تحقیقات مدرن سرطان با CRISPR، ابزار ویرایش ژن که مانند قیچی مولکولی برای تغییر ژن‌های خاص عمل می‌کند، متحول شده است. با این حال، حتی این فناوری پیشرفته نیز محدودیت‌هایی دارد، به‌ویژه هنگام مطالعه محیط‌های بیولوژیکی پیچیده مانند بافت‌های زنده واقعی یا تومورها. بیشتر غربالگری‌های CRISPR در محیط‌های مسطح و ظرف پتری (درون‌شیشه‌ای) انجام می‌شوند که واقعاً پیچیدگی طبیعی بدن را تقلید نمی‌کنند. این عدم تطابق به این معنی است که بسیاری از اهداف دارویی امیدوارکننده که در آزمایشگاه شناسایی شده‌اند، در سناریوهای واقعی با شکست مواجه شده‌اند.

CRISPR-StAR، یک پلتفرم غربالگری پیشگامانه که توسط استر اویتوال و همکارانش توسعه یافته، این شکاف را پر می‌کند. CRISPR-StAR (مخفف فعال‌سازی تصادفی توسط نوترکیبی) لنز با وضوح بالا را برای کشف عملکرد ژن در داخل موجودات زنده، نه فقط ظروف پتری، در اختیار دانشمندان قرار می‌دهد.

به طور سنتی، غربالگری‌های CRISPR در سطح ژنوم به هزاران سلول در هر هدف ژنی برای تولید داده‌های قابل اعتماد نیاز دارند. این کار در درون‌شیشه‌ای آسان است، اما هنگام کار در مدل‌های زنده، مانند موش‌ها، تقریباً غیرممکن می‌شود. فقط کسری از سلول‌های سرطانی تزریق شده زنده می‌مانند و به تومور تبدیل می‌شوند. بدتر از آن، برخی از کلون‌ها (نوادگان یک سلول ویرایش شده منفرد) بر تومور مسلط می‌شوند و سوگیری عظیمی را ایجاد می‌کنند. نتیجه؟ نویز بیش از حد، سیگنال کافی نیست.

آنچه CRISPR-StAR را منحصر به فرد می‌کند، توانایی آن در غلبه بر این آشفتگی است. این کار را از طریق یک ترفند هوشمندانه انجام می‌دهد: پس از پیوند سلول‌ها به موش‌ها و تشکیل تومورها، سیستم ویرایش CRISPR را فقط در نیمی از سلول‌های نوادگان هر کلون روشن می‌کند. نیمه دیگر از نظر ژنتیکی دست نخورده باقی می‌ماند، اساساً به عنوان یک گروه کنترل داخلی در همان تومور عمل می‌کند. مانند داشتن دوقلوهایی است که فقط یکی از آنها ویرایش ژن را دریافت می‌کند و امکان مقایسه مستقیم و دقیق آنچه که آن ژن واقعاً در زمینه بیولوژیکی دنیای واقعی انجام می‌دهد را فراهم می‌کند.

CRISPR-StAR دو نوآوری هوشمند را ترکیب می‌کند:

sgRNAهای القایی: این RNAهای راهنما، ناوبرهایی که به CRISPR می‌گویند کجا را برش دهد، می‌توانند با استفاده از یک دارو (تاموکسیفن) و یک آنزیم نوترکیبی (Cre-ERT2) روشن یا خاموش شوند. این به محققان اجازه می‌دهد زمان ویرایش ژن را کنترل کنند.

بارکدگذاری UMI: هر سلول یک بارکد منحصر به فرد دریافت می‌کند که محققان را قادر می‌سازد تا تبار هر کلون را ردیابی کرده و رفتار آنها را در طول زمان دنبال کنند.

این ابزارها در کنار هم، به CRISPR-StAR اجازه می‌دهند نه تنها نتایج ویرایش ژن را مشاهده کند، بلکه اثرات خاص را از نویز پس‌زمینه جدا کند.

آزمایش دنیای واقعی: تومورهایی که پاسخ می‌دهند

برای آزمایش CRISPR-StAR، محققان از یک رده سلولی ملانوم موشی دشوار برای مطالعه به نام Yumm450R استفاده کردند. این سلول‌ها در برابر مهارکننده‌های Braf، یک درمان رایج ملانوم، مقاوم هستند و پیوند بسیار پایین و ناهمگونی بالایی را نشان می‌دهند و آنها را به یک کابوس برای غربالگری سنتی تبدیل می‌کنند.

آنها یک کتابخانه عظیم CRISPR را که بیش از 1000 ژن را هدف قرار می‌دهد، معرفی کردند، سلول‌های ویرایش شده را با استفاده از بارکدها ردیابی کردند و ویرایش ژن را پس از تشکیل تومورها القا کردند. نتایج؟ خارق‌العاده. علی‌رغم پیچیدگی پایین (فقط 2 تا 9 سلول در هر ژن)، CRISPR-StAR داده‌های بسیار قابل تکرار و با وضوح بالا تولید کرد، چیزی که روش‌های مرسوم در دستیابی به آن ناکام ماندند.

مهم‌تر از همه، این روش وابستگی‌های ژنتیکی خاص درون‌تنی را شناسایی کرد، ژن‌هایی که فقط نقش‌های حیاتی خود را در داخل موجودات زنده نشان می‌دهند. در میان برترین نتایج، ژن‌های مرتبط با عملکرد میتوکندری، به ویژه آنهایی که به فسفوریلاسیون اکسیداتیو (OXPHOS) مرتبط بودند، قرار داشتند که نشان می‌دهد تومورها در درون‌تنی بیشتر از درون‌شیشه‌ای به متابولیسم هوازی وابسته هستند.

برای تأیید بیشتر این یافته‌ها، محققان TripleColour-StAR را توسعه دادند، یک پیچ و تاب رنگارنگ که در آن از سه پروتئین فلورسنت برای گزارش بصری نتایج ویرایش ژن استفاده شد. این امکان ردیابی بلادرنگ سلول‌های ویرایش شده ژن را در داخل تومورهای زنده فراهم کرد و رفتار منحصر به فرد ژن‌های خاص درون‌تنی را تأیید کرد.

به سوی درمان‌های بهتر سرطان

CRISPR-StAR فقط یک ارتقاء فنی نیست، بلکه می‌تواند نحوه یافتن و تأیید اهداف دارویی سرطان را تغییر دهد. غربالگری‌های سنتی CRISPR اغلب زیست‌شناسی “دنیای واقعی” تومورها را از دست می‌دهند. CRISPR-StAR با پذیرش پیچیدگی محیط درون‌تنی، این روند را معکوس می‌کند و آن را برای یافتن اهدافی که واقعاً در بیماران مهم هستند، ایده‌آل می‌کند.

همچنین تعداد حیوانات مورد نیاز برای تحقیق را کاهش می‌دهد که هم مقرون به صرفه و هم از نظر اخلاقی مطلوب است. و از آنجا که CRISPR-StAR حتی با رده‌های سلولی دشوار برای پیوند به خوبی کار می‌کند، دری را برای مطالعه طیف گسترده‌تری از سرطان‌ها، از جمله مواردی که قبلاً برای ژنومیک عملکردی بسیار چالش برانگیز تلقی می‌شدند، باز می‌کند.

CRISPR-StAR چیزی بیش از یک روش است، بلکه یک پارادایم جدید برای مطالعه عملکرد ژن در سیستم‌های زنده است. با توانایی آن در کاهش نویز، ردیابی کلون‌ها و آشکار کردن آسیب‌پذیری‌های خاص زمینه، آماده است تا به ابزاری کاربردی برای محققان سرطان و توسعه دهندگان دارو تبدیل شود.

همانطور که علم فراتر از ظرف پتری حرکت می‌کند، فناوری‌هایی مانند CRISPR-StAR برای پل زدن بین اکتشافات آزمایشگاهی و واقعیت بالینی بسیار مهم خواهند بود. از این گذشته، درمان‌های واقعی از زیست‌شناسی واقعی ناشی می‌شوند و CRISPR-StAR ما را یک قدم به رمزگشایی آن حقیقت نزدیک‌تر می‌کند.

منبع :

CRISPR-StAR enables high-resolution genetic screening in complex in vivo models