گزارشی از ویژگی‌های منحصر به فرد سیستم CRISPR–Cas9d

کشف معماری هیبریدی Cas9d برای شناسایی هدف

ساختار پروتئین Cas9d: یک دامنه REC کوچک و منحصربه‌فرد

در این پژوهش، ویژگی‌های منحصربه‌فرد سیستم Cas9d کشف شده است. این سیستم از یک معماری هیبریدی پروتئین و sgRNA برای اتصال به هدف DNA استفاده می‌کند. پروتئین Cas9d دارای یک دامنه REC نسبتاً کوچک (شامل 208 اسید آمینه) است که بین دامنه REC حداقلی پروتئین IscB (38 اسید آمینه) و دامنه‌های REC پروتئین‌های Cas9 دیگر مانند SpyCas9 (623 اسید آمینه)، FnoCas9 (775 اسید آمینه) و AceCas9 (387 اسید آمینه) قرار دارد.

تنوع اندازه دامنه REC: بازتابی از تکامل و تنوع عملکردی

بر اساس این گزارش، تنوع در اندازه دامنه‌های REC نه تنها موقعیت‌های تکاملی آن‌ها را نشان می‌دهد، بلکه دلالت بر تنوع عملکردی بین پروتئین‌های Cas9 و اجداد آن‌ها دارد.

نقش چندگانه داربست sgRNA در سیستم Cas9d

سیستم Cas9d همچنین دارای یک داربست sgRNA نسبتاً طولانی و پیچیده است. این داربست نه تنها به عنوان یک آداپتور بین پروتئین و هدف عمل می‌کند، همانطور که برای سایر پروتئین‌های مشابه Cas9 گزارش شده است، بلکه از نظر ساختاری نیز پشتیبانی می‌کند و نقش مهمی در اتصال راهنما به هدف (TS) ایفا می‌کند، مشابه آنچه در پروتئین‌های IscB مشاهده شده است. به طور خاص، ساقه 2 و ساقه 3 از sgRNA با دامنه‌های REC همکاری می‌کنند و یک ماژول عملکردی هیبریدی به نام REM را تشکیل می‌دهند.

مدل فعال‌سازی آلوستریک برای فعالیت نوکلئازی Cas9d

پیشنهاد یک مدل بر اساس آنالیزهای ساختاری و بیوشیمیایی

بر اساس آنالیزهای ساختاری و بیوشیمیایی سیستم Cas9d، نویسندگان این پژوهش یک مدل فعال‌سازی آلوستریک برای فعالیت نوکلئازی Cas9d پیشنهاد می‌کنند.

مراحل فعال‌سازی: از موقعیت‌یابی PAM تا برش DNA هدف

طبق این مدل، پس از قرارگیری PAM توسط دامنه‌های WED و PI در Cas9d، DNA دورشته‌ای توسط حلقه قفل فسفات باز می‌شود. این امر امکان جفت شدن بازهای TS با توالی راهنمای sgRNA را در مجاورت PAM فراهم می‌کند. مشابه دامنه‌های REC متعارف در سایر پروتئین‌های مشابه Cas9، ماژول REM در Cas9d تغییرات ساختاری مهمی را تجربه می‌کند که برای تشکیل کامل حلقه R و جای دادن هترودوپلکس راهنما-TS ضروری است. تشکیل هترودوپلکس راهنما-TS با طول بیش از 17 جفت باز، حرکت دامنه‌های نوکلئازی به محل برش را تسهیل می‌کند و امکان برش DNA هدف را فراهم می‌آورد.

دقت بالای Cas9d در تشخیص اهداف نامتطابق

علاوه بر این، Cas9d به دلیل نظارت دقیق بر مکمل بودن هترودوپلکس راهنما-TS توسط REM، دقت بالایی در تشخیص اهداف نامتطابق نشان می‌دهد.

تأیید نقش حیاتی ساقه‌های sgRNA در فعالیت نوکلئازی

شایان ذکر است که در طول تهیه این گزارش، پژوهش مشابهی نیز نشان داده است که ساقه‌های sgRNA از طریق حرکات هماهنگ با دامنه‌های REC برای فعالیت نوکلئازی Cas9 بسیار مهم هستند. آزمایش‌های جنبشی آن‌ها نشان داد که Cas9d سطح بالاتری از تبعیض در برابر عدم تطابق‌ها را نشان می‌دهد، که با نتایج آزمایش برش هدف نامتطابق نویسندگان این گزارش همخوانی دارد.

بینش‌های ساختاری و مکانیکی برای مهندسی بیشتر Cas9d

امکان کوچک‌تر کردن پروتئین Cas9d

این پژوهش بینش‌های ساختاری و مکانیکی را برای مهندسی بیشتر Cas9d ارائه می‌دهد. به گفته نویسندگان، خود پروتئین فشرده Cas9d می‌تواند بیشتر کوتاه شود.

نقش یک ناحیه در دامنه REC در دسترسی به هدف

آن‌ها اشاره می‌کنند که یک ناحیه درب مانند در دامنه REC از دسترسی کانال مرکزی به هدف جلوگیری می‌کند. حذف این ناحیه باعث تسریع برش هدف توسط Cas9d بدون به خطر انداختن تبعیض در برابر عدم تطابق می‌شود.

امکان کوتاه کردن داربست sgRNA

علاوه بر این، بر اساس یک مطالعه اخیر و روشنگرانه از Cas9d با استفاده از آزمایش‌های درون‌تنی E. coli، داربست sgRNA می‌تواند تا 20 درصد کوتاه شود.

حفظ فعالیت نوکلئازی با کوتاه کردن پروتئین و sgRNA

ترکیب کوتاه کردن پروتئین Cas9d و sgRNA، فعالیت نوکلئازی Cas9d را حفظ کرد، که نشان‌دهنده تطبیق‌پذیری این سیستم مهندسی شده است.

تحمل جزئی در توالی PAM و امکان توسعه انواع با PAM انعطاف‌پذیر

علاوه بر این، توالی PAM تحمل جزئی برای آدنین در موقعیت‌های (-2) و (-3) نشان داد. جهش اسید آمینه درگیر در تعامل با PAM (K715A) همچنان برش هدف را حفظ کرد، که نشان‌دهنده پتانسیل توسعه انواع با PAM انعطاف‌پذیر است.

افزایش کارایی برش با مهندسی درج دامنه

جالب توجه است که مهندسی درج دامنه باعث افزایش کارایی برش Cas9d می‌شود، که نشان‌دهنده سازگاری ماژول‌های شناسایی بین پروتئین‌های مشابه Cas9 است.

اهمیت ترکیب داده‌های ساختاری و بینش‌های تکاملی در مهندسی Cas9d

نقش داده‌های ساختاری و بیوشیمیایی در مهندسی Cas9d

این پژوهش بر ارزش ترکیب داده‌های ساختاری با بینش‌های تکاملی برای هدایت مهندسی Cas9d و بهبود ابزارهای ویرایش ژنوم تأکید می‌کند. مهندسی Cas9d در این مطالعه عمدتاً بر داده‌های ساختاری و بیوشیمیایی تعیین شده تجربی تکیه دارد که بینش‌های مهمی در مورد مکانیسم‌های اتصال به هدف و فعال‌سازی فعالیت نوکلئازی ارائه می‌دهد.

کاربرد گسترده رویکرد مبتنی بر ساختار در سایر پژوهش‌ها

رویکرد مبتنی بر ساختار به طور گسترده در سایر مطالعات مانند مهندسی SuperFi-Cas9 با دقت بالا و Cas13 با فعالیت افزایش یافته به کار رفته است.

<محدودیت‌های استفاده صرف از داده‌های تکاملی

در حالی که داده‌های تکاملی به شناسایی ویژگی‌های محافظت شده و در حال تکامل تطبیقی و همچنین فرضیه‌های عملکردی کمک می‌کند، به تنهایی برای مهندسی دقیق کافی نبوده است.

نقش روش‌های مبتنی بر هوش مصنوعی و تکنیک‌های تجربی مکمل

اخیراً، روش‌های مبتنی بر هوش مصنوعی نیز برای توسعه ابزارهای ویرایش ژنوم به کار گرفته شده‌اند. با این حال، این رویکردها همچنان به دانش ساختاری و عملکردی قبلی برای غربالگری اولیه نیاز دارند و نیازمند اعتبارسنجی تجربی هستند. علاوه بر این، تکنیک‌های تجربی مانند تکامل به کمک فاژ، استراتژی‌های جایگزینی برای مهندسی ویرایشگرهای ژنوم بدون نیاز به دانش ساختاری قبلی ارائه می‌دهند. ترکیب این رویکردهای مکمل به طور قابل توجهی تلاش‌های مهندسی پروتئین را افزایش می‌دهد و راه را برای توسعه ابزارهای ویرایش ژنوم کارآمدتر و متنوع‌تر هموار می‌کند.

منبع: Insights into the compact CRISPR–Cas9d system