تکنولوژی CRISPR-Cas طی سال‌های اخیر انقلابی در زیست‌فناوری ایجاد کرده است. در این فناوری، پروتئین‌هایی مانند Cas9 یا Cas12a با هدایت RNA به‌طور خاص بر توالی‌های ژنی عمل می‌کنند. اگرچه Cas9 ابزار رایج‌تری بوده، اما Cas12a با قابلیت‌های منحصر‌به‌فرد، به‌ویژه در ویرایش هم‌زمان چند ژن، توجه زیادی جلب کرده است.

در این پژوهش، محققان موفق به تولید موش‌هایی شدند که نسخه‌های خاصی از Cas12a (LbCas12a و enAsCas12a-HF1) را در جایگاه Rosa26 به‌صورت مشروط یا دائمی بیان می‌کنند. این مدل‌ها امکان بررسی دقیق‌تر تعاملات ژنی و عملکرد سیستم ایمنی را در شرایط in vivo و ex vivo فراهم می‌کنند.

روش کار

تولید موش‌های تراریخته: نسخه‌های بهینه‌شده از ژن Cas12a به کمک وکتور هدفمند به جایگاه Rosa26 وارد شده و توسط پروموتر CAG بیان شدند. برای کنترل بافتی و زمانی، از سیستم LoxP-Cre بهره گرفته شد.

افزودن توالی‌های NLS: به‌منظور بهبود انتقال Cas12a به هسته، از ترکیب NLSهای متفاوتی مانند SV40، Egl-13 و c-Myc استفاده شد.

برچسب‌گذاری با 3xHA و GFP: برای ردیابی پروتئین‌های بیان‌شده، از تگ‌های فلورسانس و برچسب‌های پروتئینی بهره گرفته شد.

یافته‌ها

عدم سمیت Cas12a در بافت‌ها: موش‌هایی با بیان دائمی Cas12a هیچ نشانه‌ای از سمیت بافتی نشان ندادند.

ویرایش موفق در سلول‌های ایمنی اولیه: شامل CD4+، CD8+، سلول‌های B و سلول‌های دندریتیک.

کاربرد در مدل‌سازی بیماری‌ها

خاموش‌سازی ژن TTR با استفاده از LNP حاوی crRNA، به‌منظور بررسی آمیلوئیدوز.

حذف هم‌زمان ژن‌های Trp53، Apc، Pten و Rb1 با یک وکتور AAV منجر به ایجاد سریع مدل‌های سرطان ریه و غدد بزاقی شد.

ادغام با سیستم CRISPRa: ایجاد مدل دوگانه فعال‌سازی و خاموش‌سازی ژنی (DAKO system).

نتیجه‌گیری

ایجاد موش‌های Cas12a-knock-in بستر قدرتمندی برای مهندسی ژنتیک چندگانه در شرایط زنده فراهم می‌کند. این مدل‌ها قابلیت‌های گسترده‌ای در درک تعاملات ژنی، مدل‌سازی بیماری‌ها و طراحی درمان‌های نوین برای بیماری‌های پیچیده از جمله سرطان، بیماری‌های خودایمنی و عصبی دارند.

منبع : موش‌های Knock-in شده با Cas12a برای ویرایش ژنومی چندگانه، مدل‌سازی بیماری و مهندسی سلول‌های ایمنی