مطالعه غربالگری CRISPR برای پیری زودرس

در یک مطالعه پیشگامانه که به تازگی منتشر شده است، گروهی از محققان به بررسی مکانیسم های سلولی زیربنای سندرم پیری زودرس نادر به نام نوتروپنی مادرزادی شدید (NGPS) پرداخته اند. این سندرم که با جهش در ژن BAF ایجاد می شود، منجر به طیف وسیعی از مشکلات سلامتی از جمله ناهنجاری های اسکلتی، پیری زودرس و کاهش طول عمر می شود.

در این پژوهش که با عنوان “یک غربالگری CRISPR چند پارامتری ضد پیری، نقش BAF را در تنظیم سنتز پروتئین آشکار می کند” منتشر شده است، محققان از یک روش غربالگری ژنومی مبتنی بر میکروسکوپ و فناوری CRISPR/Cas9 استفاده کردند تا ژن های دخیل در سرکوب و دور زدن فنوتیپ های پروژریک در فیبروبلاست های مشتق شده از بیماران NGPS را شناسایی کنند.

رویکرد غربالگری ژنومی مبتنی بر CRISPR/Cas9

محققان برای بررسی نقش ژن های مختلف در NGPS، یک غربالگری جامع را بر روی کل ژنوم کد کننده پروتئین انسان (19200 ژن) انجام دادند. این رویکرد در مقایسه با غربالگری های قبلی که تنها مجموعه محدودی از ژن ها (320 ژن) را هدف قرار داده بودند، بسیار گسترده تر بود. نکته قابل توجه دیگر در مطالعه حاضر، استفاده از سلول های بیماران NGPS بود. در حالی که مطالعات قبلی عمدتاً بر مدل های سلولی مهندسی شده تکیه داشتند، این پژوهش به طور مستقیم اثرات جهش BAF را در سلول های واقعی بیماران مورد بررسی قرار داد.

با این حال، محققان اذعان داشتند که به دلیل محدودیت های موجود در دسترسی به سلول های اولیه بیماران NGPS، مجبور به استفاده از فیبروبلاست های جاودانه شده بودند. سلول های اولیه NGPS به دلیل ناتوانی در رشد در محیط کشت، برای مطالعات گسترده مناسب نیستند. این محدودیت، امکان انجام برخی از آزمایش های عملکردی مانند بررسی طول عمر تکثیری یا سنجش مهاجرت سلولی را از بین می برد. با این وجود، سلول های جاودانه شده مزایای قابل توجهی برای غربالگری های بزرگ مقیاس دارند، به ویژه هنگامی که نیاز به ایجاد کلون های بیان کننده Cas9 از سلول های منفرد وجود دارد.

برای اطمینان از اعتبار نتایج، محققان از دو نوع فیبروبلاست استفاده کردند: فیبروبلاست های WT (وحشی) از یک فرد سالم و فیبروبلاست های NGPS که در آنها جهش هموزیگوت BAF A12T با استفاده از CRISPR/Cas9 معکوس شده بود. این امر به آنها اجازه داد تا ترکیبی قابل اعتماد از چهار فنوتیپ سلولی را شناسایی کنند که هم به طور خاص مربوط به جهش BAF A12T بودند و هم با میکروسکوپ پرتوان قابل کمی سازی بودند.

این رویکرد غربالگری چند پارامتری به محققان کمک کرد تا تعداد “هیت ها” (ژن های کاندید) را به حدود 0.2 درصد از کل کتابخانه ژنومی کاهش دهند و ژن هایی را شناسایی کنند که بهترین “نجات” را در بین چندین فنوتیپ نشان می دهند.

شناسایی ژن های مرتبط با عملکرد هسته و استخوان

بر اساس اصل “نجات مصنوعی”، محققان دریافتند که تنها 3 مورد از هیت ها پروتئین های NE (پوشش هسته ای) هستند، به طور مشخص تر پروتئین های کمپلکس منافذ هسته ای: NUP160، SEC13 و AHCTF1 (ELYS). مطالعات قبلی نشان داده بودند که SEC13 و ELYS هر دو اندازه هسته و انتقال هسته ای را تنظیم می کنند، عملکردی که توسط RAN، یکی دیگر از هیت های غربالگری، به اشتراک گذاشته می شود. این یافته ها نشان می دهد که تعدیل انتقال هسته ای ممکن است اثرات مثبتی بر سازماندهی و عملکرد NE در سلول های NGPS داشته باشد.

با توجه به ناهنجاری های اسکلتی شدید بیماران NGPS، محققان به طور ویژه به شناسایی دو ژن دخیل در تکامل استئوکلاست توجه کردند: LRRK1 (کیناز 1 پروتئین سرشار از لوسین-تکرار سرین/ترئونین) و PAFAH1B1/LIS1 (زیر واحد آلفای استیل هیدرولاز IB فاکتور فعال کننده پلاکت). کاهش سطح هر دو ژن، فنوتیپ های سلولی NGPS را بهبود بخشید. در مورد LIS1، کاهش آن همچنین بقای کرم های NGPS را افزایش داد.

LRRK1 در تنظیم فعالیت استئوکلاست و بازجذب استخوان نقش دارد. اختلال عملکرد LRRK1 در موش ها یا انسان با استئوپتروز شدید مرتبط است. به طور مشابه، PAFAH1B1 تشکیل استئوکلاست و هموستاز استخوان را از طریق تعامل با پروتئین Plekhm1 تنظیم می کند که در ترشح استئوکلاست نقش دارد. نشان داده شده است که کاهش PAFAH1B1 به شدت تشکیل استئوکلاست را کاهش می دهد.

بر این اساس، محققان این فرضیه را مطرح کردند که پوکی استخوان و استئولیز شدید مشاهده شده در سلول های NGPS ممکن است با افزایش سطح یا فعالیت LRRK1 و/یا PAFAH1B1 مرتبط باشد. این امر می تواند به فنوتیپ های سلولی غیرطبیعی NGPS کمک کند که با کاهش سطح این ژن ها به حالت عادی باز می گردند.

محققان پیشنهاد کردند که در آزمایش های بعدی، بررسی اثر جهش BAF A12T در رده های سلولی مشتق شده از استخوان و تعیین مزیت کاهش LRRK1 و PAFAH1B1 در پاسخ این سلول ها به استرس مکانیکی جالب خواهد بود. همچنین، هنگامی که یک مدل موش برای NGPS در دسترس قرار گیرد، آزمایش اینکه چگونه تعدیل این ژن ها می تواند فنوتیپ های موش ها را در شرایط in vivo بهبود بخشد، بسیار مرتبط خواهد بود.

استفاده از کرم الگانس به عنوان مدل عملکردی

به دلیل عدم وجود سلول های اولیه NGPS و به دلیل اینکه کرم الگانس یک مدل بسیار ارزشمند برای مطالعه مکانیسم های پیری است، محققان تصمیم گرفتند از این موجود برای انجام آزمایش های عملکردی استفاده کنند. مطالعات متعدد نشان داده اند که مداخلاتی که طول عمر را در کرم ها افزایش یا کاهش می دهند، اثرات مشابهی در سایر حیوانات، از جمله پستانداران، دارند. ثانیاً، حفاظت قوی BAF در سراسر پادشاهی حیوانات، هم از نظر توالی اسید آمینه اولیه و هم ساختار ثانویه پیش بینی شده، به نفع حفاظت عملکردی است. به عنوان مثال، نشان داده شده است که فسفوریلاسیون BAF توسط کیناز VRK1 دینامیک BAF را به طور مشابه در کرم ها، مگس ها و سلول های انسانی تنظیم می کند.

علاوه بر این، کار اخیر این گروه نشان می دهد که مدل کرم الگانس NGPS فنوتیپ های فیبروبلاست های بیمار NGPS را بازسازی می کند. این فنوتیپ ها شامل تخریب مورفولوژی هسته با افزایش سن، کاهش ادغام امرین در NE، بزرگ شدن هستک و عدم تنظیم ژن های ریبوزومی است. این فنوتیپ ها با کاهش طول عمر و تغییر مقاومت به استرس مرتبط هستند.

نقش سنتز پروتئین در پیری زودرس NGPS

یکی از غنی‌سازی‌های عملکردی برتر در غربالگری، سنتز پروتئین بود، به طوری که 7 مورد از 43 هیت مرتبط با این فرآیند بودند. از دست دادن هموستاز پروتئین یکی از نشانه های پیری است و مهار ترجمه با افزایش طول عمر در چندین مدل حیوانی مرتبط بوده است. بنابراین، شناسایی اینکه مهار این مسیر برای سلول های NGPS و کرم های NGPS مفید است، فرضیه فعلی را تقویت می کند که از دست دادن هموستاز سلولی مشاهده شده در پیری زودرس و فیزیولوژیکی ممکن است از طریق مکانیسم های مشابهی رخ دهد.

به طور خاص تر، محققان مشاهده کردند که جهش BAF A12T مرتبط با NGPS با سرعت بالاتر سنتز پروتئین تازه متولد شده، همراه با بیان متفاوت ژن های دخیل در تنظیم ترجمه مرتبط است. مقاله اخیراً منتشر شده آنها همچنین نشان می دهد که جهش A12T به طور مستقیم بر مشخصات اتصال DNA BAF تأثیر می گذارد و منجر به بیان متفاوت ژن های دخیل در ساختار ریبوزومی و ترجمه می شود. جالب توجه است، تقریباً تمام ژن های ریبوزومی که در کرم های NGPS به طور متفاوت بیان می شدند، کمتر از BAF-1 وحشی با BAF-1(G12T) مرتبط بودند. این نشان می دهد که جهش BAF A12T ممکن است به طور غیرمستقیم بر ترجمه با تعدیل مشخصات اتصال DNA خود تأثیر بگذارد، بنابراین بیان ژن های مرتبط با ترجمه را تغییر می دهد.

بنابراین، عدم تنظیم ترجمه – که به طور بالقوه از طریق مکانیسم های مختلف رخ می دهد – می تواند یک فرآیند مشترک باشد که در پیری زودرس نقش دارد، زیرا افزایش سنتز پروتئین نیز در سلول های اولیه HGPS مشاهده شد و به طور مشابه با افزایش اندازه هستک همراه بود. در مورد NGPS، محققان مشاهده کردند که این با نرخ بالاتر خطاها، همانطور که با افزایش خوانش کدون توقف مشاهده شد، مرتبط است.

بنابراین به نظر می رسد که فیبروبلاست های مشتق شده از بیماران HGPS و NGPS هر دو در حالی که هنوز در حالت تکثیری هستند (شماره پاساژ پایین در مورد سلول های اولیه HGPS یا جاودانگی در مورد NGPS) از مرحله سنتز پروتئین افزایش یافته عبور می کنند. از آنجایی که ترجمه یکی از پرمصرف‌ترین فرآیندهای انرژی‌زا در سلول است، این امر می‌تواند خستگی سلولی را تسریع کند و به ورود زودرس سلول‌ها به پیری کمک کند. هنگامی که سلول ها وارد پیری می شوند، سنتز پروتئین جهانی کاهش یافته را نشان می دهند. از آنجایی که سلول های NGPS جاودانه شده اند، محققان نمی توانند اثر کاهش سنتز پروتئین را بر طول عمر تکثیری سلول ها در محیط کشت ارزیابی کنند و بنابراین نمی توانند نجات فنوتیپی را به پیری سلولی مرتبط کنند.

مدل های حیوانی و مداخلات دارویی

در حال حاضر هیچ مدل موشی برای NGPS وجود ندارد، اما یک مطالعه اخیر اثر سنتز پروتئین مستعد خطا را در موش ها گزارش کرده است. محققان از طریق مهندسی یک جهش ریبوزومی خاص، خطاهای ترجمه ژنومی را در موش ها القا کردند. این منجر به کاهش طول عمر و ویژگی های پیری زودرس شبیه به فنوتیپ های مشاهده شده در بیماران NGPS از جمله تغییر شکل قفسه سینه و ستون فقرات و همچنین از دست دادن چربی شد. این نشان می دهد که عدم تنظیم سنتز پروتئین و تجمع خطاها ممکن است مستقیماً در فنوتیپ های پیری زودرس بیماران NGPS نقش داشته باشد.

بنابراین، شناسایی مداخلات دارویی غیر سمی برای کاهش سرعت سنتز پروتئین، و در نتیجه به طور بالقوه محدود کردن ترجمه مستعد خطا، ممکن است بهبود فنوتیپی را در سطح افراد به همراه داشته باشد. بر اساس داده های این مطالعه، این امر می تواند از طریق هدف قرار دادن پروتئین های دخیل در سنتز پروتئین (مانند پروتئین های RPL) و همچنین پروتئین های دخیل در عملکردهای مختلف سلولی دیگر به دست آید. در واقع، در زمینه سلولی NGPS، محققان کاهش سنتز پروتئین تازه متولد شده را پس از کاهش سطح ژن هایی که هیچ عملکرد سنتز پروتئین شناخته شده ای ندارند، مشاهده کردند. مکانیسم های پشت این موضوع و ارتباط بین ترجمه پروتئین و یکپارچگی NE ناشناخته باقی مانده است و اساس مطالعات آینده خواهد بود، اما این نشان دهنده یک مکانیسم مشترک است که به موجب آن کاهش سطح هیت ها از غربالگری، فنوتیپ های NGPS را بهبود می بخشد.

منبع: یک غربالگری CRISPR چند پارامتری ضد پیری، نقش BAF را در تنظیم سنتز پروتئین آشکار می کند.