نکات عملی برای موفقیت در استخراج RNA با ترایزول

استخراج RNA با ترایزول یک فرآیند قدرتمند است، اما برای دستیابی به بهترین نتایج، رعایت دقیق پروتکل و توجه به جزئیات بسیار مهم است. در اینجا به برخی از نکات عملی که می‌توانند به موفقیت شما کمک کنند، اشاره می‌کنیم:

حفظ محیط بدون RNase

RNaseها  دشمنان اصلی RNA هستند. برای جلوگیری از تخریب نمونه، باید از ابتدا تا انتها یک محیط عاری از RNase حفظ شود:

سطوح و ابزار:  از سطوح کاری تمیز، دستکش‌های عاری از پودر، و ابزارآلات استریل و عاری از RNase استفاده کنید.

آب و بافرها:  از آب بدون RNase (diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water یا آب مولکولی گرید تجاری بدون RNase) برای حل کردن RNA نهایی و تهیه بافرها استفاده کنید.

ظروف پلاستیکی:  از لوله‌های میکروفیوژ و نوک سمپلرهای استریل و عاری از RNase استفاده کنید.

جدا نگه داشتن ریجنت‌ها: ریجنت‌های مربوط به RNA را هرگز با ریجنت‌های DNA یا پروتئین مخلوط نکنید.

آماده‌سازی و نگهداری نمونه

کیفیت نمونه اولیه بیشترین تأثیر را بر کیفیت RNA نهایی دارد:

جمع‌آوری سریع نمونه: پس از جمع‌آوری نمونه (بافت یا سلول)، باید بلافاصله آن را در ترایزول غوطه‌ور کرد یا به سرعت فریز کرد (مثلاً در نیتروژن مایع) تا فعالیت RNaseها به حداقل برسد.

هموژن‌سازی کامل: هموژن‌سازی کامل نمونه در ترایزول برای اطمینان از لیز شدن مؤثر سلول‌ها و آزاد شدن RNA ضروری است. برای بافت‌ها می‌توان از هاون و دسته هاون خنک شده در نیتروژن مایع، یا هموژنایزرهای مکانیکی استفاده کرد. برای سلول‌های کشت شده، معمولاً پیپتاژ مکرر کافی است.

دقت در جداسازی فازها

مرحله جداسازی فازها پس از افزودن کلروفرم و سانتریفیوژ، بسیار حیاتی است:

جدا کردن دقیق فاز آبی: فاز آبی بالایی باید با دقت بسیار بالایی جدا شود تا از آلودگی با فاز میانی (حاوی DNA و پروتئین) و فاز آلی (حاوی فنول) جلوگیری شود. استفاده از یک سمپلر با نوک بلند و شفاف برای برداشتن فاز آبی توصیه می‌شود. حتی مقدار کمی از فاز میانی یا آلی می‌تواند کیفیت RNA را به شدت کاهش دهد.

شستشوی کامل و خشک کردن صحیح RNA

شستشو با اتانول ۷۵%:  حداقل یک بار شستشو با اتانول ۷۵% برای حذف آلودگی‌ها کافی است، اما برای نمونه‌های حساس یا زمانی که خلوص بالا نیاز است، دو بار شستشو توصیه می‌شود.

خشک کردن پلت (Pellet) RNA: پلت RNA باید پس از شستشو، کاملاً از اتانول خشک شود. با این حال، از خشک کردن بیش از حد (over-drying) خودداری کنید، زیرا این کار می‌تواند حل کردن مجدد RNA را دشوار کند. یک خشک کردن مختصر در دمای اتاق یا استفاده از اسپیدواک (SpeedVac) به مدت کوتاه معمولاً کافی است. نباید هیچ قطره اتانولی در ته لوله باقی بماند.

ذخیره‌سازی RNA

RNA استخراج شده بسیار حساس به تخریب است. برای نگهداری طولانی‌مدت، باید در دمای ۸۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شود. برای استفاده‌های کوتاه‌مدت، می‌توان آن را در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری کرد، اما از چرخه‌های ذوب و انجماد مکرر خودداری شود.

 ارزیابی کیفیت و کمیت RNA

پس از استخراج، ارزیابی کیفیت و کمیت RNA ضروری است:

کمی‌سازی (Quantification): با استفاده از نانودراپ (NanoDrop)، Qubit یا فلورومتر برای تعیین غلظت RNA. نسبت‌های A260/A280 و A260/A230 برای ارزیابی خلوص (A260/A280 حدود 2.0 و A260/A230 حدود 2.0-2.2 نشان‌دهنده خلوص بالا است).

یکپارچگی (Integrity): با استفاده از الکتروفورز در ژل آگارز (برای مشاهده باندهای rRNA) یا دستگاه‌هایی مانند Bioanalyzer (برای تعیین شاخص یکپارچگی RNA یا RIN) برای اطمینان از عدم تخریب RNA

برای مشاهده ی محصول ترایزول شرکت زاور زیست آزما اینجا کلیک کنید.