تحویل ایمن و غیرویروسی DNA با استفاده از نانوذرات لیپیدی بارگذاری شده با لیپیدهای ضد التهابی درون‌زا

مقدمه: اهمیت و چالش‌های تحویل DNA با استفاده از نانوذرات لیپیدی

در سال‌های اخیر، استفاده از نانوذرات لیپیدی (LNPs) به عنوان یک سیستم تحویل کارآمد برای مولکول‌های درمانی مختلف، از جمله اسیدهای نوکلئیک، توجه گسترده‌ای را به خود جلب کرده است. موفقیت چشمگیر واکسن‌های mRNA مبتنی بر LNP در مقابله با بیماری همه‌گیر کووید-۱۹، ارزش این فناوری را به خوبی نشان داد. با این حال، استفاده از LNPها برای تحویل پلاسمید DNA (pDNA) می‌تواند مزایای بیشتری را به همراه داشته باشد، از جمله بیان ژن طولانی‌مدت‌تر و امکان استفاده از توالی‌های پروموتر برای کنترل دقیق بیان ژن.

با وجود این مزایای بالقوه، تحویل pDNA با استفاده از LNPها با چالش‌های قابل توجهی روبرو است. دو مورد از مهم‌ترین این چالش‌ها عبارتند از سمیت و کارایی پایین تحویل. سمیت ناشی از برهمکنش LNPها و pDNA با سیستم ایمنی بدن می‌تواند منجر به پاسخ‌های التهابی نامطلوب شود. از طرف دیگر، کارایی پایین تحویل به این معنی است که تنها بخش کوچکی از pDNA بارگذاری شده در LNPها به هسته سلول‌های هدف می‌رسد، جایی که می‌تواند بیان ژن را آغاز کند.

تحقیقات متعددی برای غلبه بر این چالش‌ها و بهبود ایمنی و کارایی تحویل pDNA با استفاده از LNPها انجام شده است. یکی از رویکردهای امیدوارکننده، استفاده از مواد درون‌زا برای تعدیل پاسخ‌های ایمنی و افزایش نفوذ LNPها به سلول‌ها است.

روش‌ها: استفاده از لیپیدهای ضد التهابی درون‌زا برای کاهش التهاب ناشی از pDNA-LNPs

مطالعه‌ای که در این گزارش به آن می‌پردازیم، به بررسی مکانیسم‌های التهابی ناشی از pDNA-LNPs در موش‌های نابالغ پرداخته و راهکاری نوین برای کاهش این التهاب و بهبود تحویل pDNA ارائه داده است. محققان در این مطالعه نشان دادند که pDNA-LNPs در موش‌های نابالغ باعث ایجاد التهاب حاد می‌شوند که عمدتاً از طریق مسیر cGAS–STING هدایت می‌شود. این مسیر ایمنی ذاتی نقش مهمی در تشخیص DNA سیتوزولی (DNA خارج از هسته) ایفا می‌کند و فعال شدن آن می‌تواند منجر به تولید سیتوکین‌های التهابی شود.

با الهام از ویروس‌های DNA که برای تکثیر خود این مسیر را مهار می‌کنند، محققان تصمیم گرفتند لیپیدهای درون‌زایی را که می‌توانند مسیر STING را مهار کنند، در pDNA-LNPs بارگذاری کنند. آن‌ها از نیترو-اولئیک اسید (NOA) به عنوان یک لیپید ضد التهابی درون‌زا استفاده کردند که قبلاً نشان داده شده بود می‌تواند فعالیت مسیر STING را مهار کند.

برای ارزیابی اثربخشی این رویکرد، محققان NOA را در pDNA-LNPs بارگذاری کردند و این نانوذرات جدید را NOA-pDNA-LNPs نامیدند. سپس آن‌ها پاسخ‌های التهابی و میزان بیان ژن را در موش‌هایی که با pDNA-LNPs معمولی و NOA-pDNA-LNPs درمان شده بودند، مقایسه کردند. علاوه بر این، برای بهینه‌سازی بیشتر بیان ژن، محققان یک غربالگری کوچک از فرمولاسیون‌های مختلف LNP انجام دادند. این غربالگری شامل تغییر پارامترهای مختلف فرمولاسیون LNP برای شناسایی ترکیباتی بود که منجر به بالاترین سطح بیان ژن در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) می‌شوند.

شناسایی مسیر cGAS–STING به عنوان عامل اصلی التهاب ناشی از pDNA-LNPs

اولین گام در این تحقیق، شناسایی دقیق مکانیسم‌های مولکولی دخیل در پاسخ التهابی ناشی از pDNA-LNPs بود. محققان با استفاده از تکنیک‌های مختلف بیوشیمیایی و ایمونوهیستوشیمی، نشان دادند که فعال شدن مسیر cGAS–STING نقش کلیدی در این فرآیند ایفا می‌کند. آنزیم cGAS (Cyclic GMP-AMP synthase) یک حسگر DNA سیتوزولی است که در صورت تشخیص DNA، مولکول cGAMP (cyclic GMP-AMP) را تولید می‌کند. cGAMP به نوبه خود پروتئین STING (Stimulator of Interferon Genes) را فعال می‌کند، که منجر به تولید سیتوکین‌های پیش‌التهابی مانند اینترفرون نوع یک می‌شود.

نتایج این بخش از تحقیق نشان داد که pDNA-LNPs به طور موثری DNA را به سیتوزول سلول‌ها تحویل می‌دهند، جایی که توسط cGAS شناسایی شده و مسیر STING را فعال می‌کند. این فعال شدن منجر به آبشاری از رویدادهای التهابی می‌شود که می‌تواند سمیت و کارایی تحویل pDNA را محدود کند.

طراحی NOA-pDNA-LNPs برای مهار التهاب

با شناسایی مسیر cGAS–STING به عنوان عامل اصلی التهاب، محققان به دنبال راهی برای مهار این مسیر با استفاده از مواد درون‌زا بودند. آن‌ها نیترو-اولئیک اسید (NOA) را به عنوان یک کاندید مناسب انتخاب کردند. NOA یک لیپید نیتراته است که به طور طبیعی در بدن تولید می‌شود و دارای خواص ضد التهابی متعددی است. مطالعات قبلی نشان داده بود که NOA می‌تواند به طور مستقیم با پروتئین STING برهمکنش داشته و فعالیت آن را مهار کند.

بر این اساس، محققان فرمولاسیون LNPها را تغییر دادند تا NOA را به همراه pDNA در داخل نانوذرات بارگذاری کنند. هدف از این کار، رساندن NOA به همان سلول‌هایی بود که pDNA را دریافت کرده‌اند، به این ترتیب می‌توان به طور موضعی پاسخ التهابی را مهار کرده و در عین حال امکان بیان ژن از pDNA را فراهم کرد.

غربالگری و بهینه‌سازی فرمولاسیون LNP در شرایط آزمایشگاهی

علاوه بر استفاده از NOA برای کاهش التهاب، محققان تلاش کردند تا کارایی تحویل pDNA و بیان ژن را از طریق بهینه‌سازی فرمولاسیون LNP بهبود بخشند. آن‌ها یک غربالگری کوچک از فرمولاسیون‌های مختلف LNP انجام دادند که شامل تغییر نسبت‌های اجزای مختلف LNP (مانند لیپیدهای کاتیونی، لیپیدهای کمکی، کلسترول و PEGylated lipid) بود.

این غربالگری در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) و با استفاده از سلول‌های کشت شده انجام شد. محققان فرمولاسیون‌های مختلف LNP را با pDNA بارگذاری کرده و میزان بیان ژن گزارشگر (reporter gene) را در سلول‌ها اندازه‌گیری کردند. نتایج این غربالگری نشان داد که تغییرات کوچک در ترکیب LNP می‌تواند تاثیر قابل توجهی بر میزان بیان ژن داشته باشد. در نهایت، آن‌ها موفق شدند یک فرمولاسیون بهینه LNP را شناسایی کنند که در شرایط آزمایشگاهی منجر به افزایش 50 برابری بیان ژن در مقایسه با فرمولاسیون اولیه شد.

نتایج: کاهش التهاب و افزایش بیان ژن طولانی‌مدت با استفاده از NOA-pDNA-LNPs

نتایج آزمایش‌های انجام شده در این مطالعه نشان داد که بارگذاری NOA در pDNA-LNPs (NOA-pDNA-LNPs) به طور موثری پاسخ‌های التهابی جدی را در موش‌های زنده (in vivo) کاهش می‌دهد. موش‌های دریافت کننده NOA-pDNA-LNPs در مقایسه با موش‌های دریافت کننده pDNA-LNPs معمولی، علائم کمتری از التهاب حاد نشان دادند. این امر منجر به بیان ژن ایمن‌تر و طولانی‌مدت‌تر شد.

یکی از یافته‌های قابل توجه این مطالعه، مقایسه میزان بیان ژن بین NOA-pDNA-LNPs و mRNA-LNPs بود. در روز 32 پس از تزریق، میزان بیان ژن در گروه NOA-pDNA-LNPs به طور متوسط 11.5 برابر بیشتر از گروه mRNA-LNPs بود. این نشان می‌دهد که تحویل pDNA با استفاده از LNPهای بارگذاری شده با NOA می‌تواند منجر به بیان ژن پایدارتر و طولانی‌مدت‌تری در مقایسه با mRNA شود. این مزیت می‌تواند در کاربردهای ژن‌درمانی که نیاز به بیان ژن برای مدت زمان طولانی دارند، بسیار مهم باشد.

علاوه بر این، نتایج غربالگری فرمولاسیون LNP در شرایط آزمایشگاهی نشان داد که با بهینه‌سازی ترکیب LNP، می‌توان میزان بیان ژن را به طور قابل توجهی افزایش داد. فرمولاسیون بهینه شناسایی شده در این مطالعه منجر به افزایش 50 برابری بیان ژن در مقایسه با فرمولاسیون اولیه شد. این نشان می‌دهد که رویکرد ترکیبی استفاده از NOA برای کاهش التهاب و بهینه‌سازی فرمولاسیون LNP برای افزایش کارایی تحویل می‌تواند یک استراتژی موثر برای توسعه سیستم‌های تحویل pDNA مبتنی بر LNP باشد.

بحث: چشم‌انداز استفاده از NOA-pDNA-LNPs در پزشکی ژنتیک

نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که بارگذاری لیپید ضد التهابی درون‌زا NOA در pDNA-LNPs می‌تواند به طور موثری سمیت ناشی از تحویل DNA غیرویروسی را کاهش داده و در عین حال امکان بیان ژن طولانی‌مدت را فراهم کند. این یافته‌ها از اهمیت بالایی برخوردارند، زیرا تحویل ایمن و کارآمد pDNA همچنان یک چالش کلیدی در زمینه پزشکی ژنتیک است.

مزیت اصلی pDNA نسبت به mRNA، پایداری بیشتر آن و امکان استفاده از توالی‌های پروموتر برای کنترل دقیق زمان، مکان و سطح بیان ژن است. با این حال، سمیت و کارایی پایین تحویل pDNA با استفاده از سیستم‌های غیرویروسی، کاربرد بالینی آن را محدود کرده است. مطالعه حاضر با ارائه راهکاری برای کاهش سمیت و بهبود بیان ژن طولانی‌مدت، گام مهمی در جهت رفع این محدودیت‌ها برداشته است.

استفاده از لیپیدهای ضد التهابی درون‌زا مانند NOA یک رویکرد هوشمندانه برای تعدیل پاسخ‌های ایمنی ناشی از تحویل DNA است. از آنجایی که NOA به طور طبیعی در بدن تولید می‌شود، احتمال ایجاد پاسخ‌های ایمنی نامطلوب در مقایسه با مواد خارجی کمتر است. علاوه بر این، توانایی NOA در مهار مسیر STING، که نقش کلیدی در التهاب ناشی از DNA سیتوزولی ایفا می‌کند، آن را به یک عامل درمانی بالقوه برای بهبود ایمنی تحویل pDNA تبدیل کرده است.

بهینه‌سازی فرمولاسیون LNP نیز نقش مهمی در افزایش کارایی تحویل pDNA ایفا می‌کند. نتایج غربالگری انجام شده در این مطالعه نشان می‌دهد که تغییرات کوچک در ترکیب LNP می‌تواند تاثیر قابل توجهی بر میزان بیان ژن داشته باشد. شناسایی فرمولاسیون‌های بهینه می‌تواند منجر به افزایش میزان pDNA که به هسته سلول‌های هدف می‌رسد و در نتیجه افزایش سطح بیان ژن شود.

در مجموع، رویکرد ترکیبی استفاده از NOA برای کاهش التهاب و بهینه‌سازی فرمولاسیون LNP برای افزایش کارایی تحویل، پتانسیل بالایی برای پیشرفت پزشکی ژنتیک دارد. NOA-pDNA-LNPs می‌توانند در کاربردهای مختلفی مورد استفاده قرار گیرند، از جمله ژن‌درمانی بیماری‌های ژنتیکی، توسعه واکسن‌های DNA با اثربخشی طولانی‌مدت و تحقیقات پایه در زمینه تنظیم بیان ژن.

نتیجه‌گیری

این مطالعه با ارائه شواهدی مبنی بر امکان تحویل ایمن‌تر و کارآمدتر pDNA با استفاده از نانوذرات لیپیدی بارگذاری شده با لیپید ضد التهابی درون‌زا NOA، گام مهمی در جهت توسعه سیستم‌های تحویل ژن غیرویروسی برداشته است. کاهش التهاب و افزایش بیان ژن طولانی‌مدت در مقایسه با mRNA-LNPs، NOA-pDNA-LNPs را به یک ابزار امیدوارکننده برای پیشبرد پزشکی ژنتیک تبدیل می‌کند. تحقیقات آینده می‌تواند بر روی بهینه‌سازی بیشتر این سیستم تحویل، بررسی کاربردهای آن در مدل‌های بیماری مختلف و ارزیابی ایمنی و اثربخشی آن در شرایط بالینی متمرکز شود.

منبع

Safer non-viral DNA delivery using lipid nanoparticles loaded with endogenous anti-inflammatory lipids