گزارش بهینه سازی سیستم نوین بیان برای تولید پروتئین های نوترکیب در سلول های CHO

مقدمه ای بر اهمیت پروتئین های نوترکیب در درمان بیماری ها

در دنیای پزشکی مدرن، پروتئین های نوترکیب به عنوان ابزاری قدرتمند در درمان بیماری های گوناگون، به ویژه سرطان، ظهور کرده اند. این پروتئین ها، که به طور خاص در آزمایشگاه ها طراحی و تولید می شوند، قادرند مکانیسم های پیچیده بیماری ها را هدف قرار داده و اثرات درمانی چشمگیری ایجاد کنند. از این رو، صنعت داروسازی به شدت به دنبال روش های کارآمدتر و مقرون به صرفه تر برای تولید این داروها است.

تولید پروتئین های درمانی، به ویژه پروتئین های پیچیده با ساختار سه بعدی و عملکردهای حیاتی، نیازمند سیستم های بیانی پیشرفته است. در میان سیستم های مختلف، سلول های پستانداران به دلیل توانایی منحصر به فرد خود در تاخوردگی و گلیکوزیلاسیون پروتئین ها، به عنوان میزبان های ارجح شناخته می شوند. این فرآیندها برای اطمینان از عملکرد صحیح و ایمنی پروتئین های درمانی در بدن انسان ضروری هستند.

سلول های CHO: میزبان غالب در تولید داروهای زیستی

در حال حاضر، سلول های تخمدان همستر چینی (CHO) به عنوان پرکاربردترین رده سلولی پستانداران در تولید داروهای زیستی نوترکیب به شمار می روند. این برتری به دلایل متعددی از جمله ایمنی اثبات شده در انسان، توانایی ایجاد الگوهای گلیکوزیلاسیون مشابه با پروتئین های انسانی، سیستم های ژنتیکی مناسب برای تکثیر ژن و قابلیت رشد آسان در محیط های کشت معلق نسبت داده می شود.

با وجود مزایای فراوان سلول های CHO، چالش های مهمی در زمینه توسعه سریع و کارآمد رده های سلولی با توانایی تولید بالا همچنان وجود دارد. بهینه سازی سیستم های بیانی در این سلول ها، به منظور افزایش بازده و کاهش هزینه های تولید، از اهمیت ویژه ای برخوردار است.

CRISPR/Cas9: ابزاری نوین در مهندسی رده های سلولی

فناوری CRISPR/Cas9 به عنوان یک سیستم ویرایش ژنوم قدرتمند، انقلابی در عرصه مهندسی سلولی ایجاد کرده است. این فناوری به دانشمندان امکان می دهد تا با دقت، سرعت و کارایی بی سابقه ای، تغییرات ژنتیکی مورد نظر خود را در سلول های پستانداران اعمال کنند. از جمله کاربردهای CRISPR/Cas9 می توان به ترکیب ژن های متعدد در یک یا چند جایگاه ژنومی، حذف کامل ژن ها و یا کاهش بیان ژن های خاص اشاره نمود.

توالی کوزاک و رهبر: عوامل کلیدی در ترجمه کارآمد پروتئین

توالی کوزاک، یک توالی نوکلئوتیدی خاص در mRNA، نقش حیاتی در آغاز فرآیند ترجمه و سنتز پروتئین ایفا می کند. این توالی، که در بالادست کدون آغاز (AUG) قرار دارد، به ریبوزوم ها کمک می کند تا به طور موثر به mRNA متصل شده و ترجمه را آغاز کنند. مطالعات نشان داده اند که تغییرات در توالی کوزاک می تواند به طور قابل توجهی بر کارایی ترجمه تاثیر گذاشته و حتی در بروز برخی بیماری ها در انسان نقش داشته باشد.

علاوه بر توالی کوزاک، توالی های رهبر نیز به عنوان عوامل موثر در ترجمه پروتئین شناخته می شوند. این توالی ها، که در بخش 5’UTR mRNA قرار دارند، می توانند طول و موقعیت های متفاوتی داشته باشند و در نتیجه بر کارایی ترجمه پروتئین های مختلف تاثیر بگذارند. به همین دلیل، افزودن توالی های کوزاک و رهبر به وکتورهای بیانی می تواند راهکاری موثر برای افزایش سطح بیان پروتئین های نوترکیب باشد.

هدف مطالعه: بهینه سازی سیستم بیان پروتئین در سلول های CHO

با توجه به اهمیت سلول های CHO در تولید پروتئین های درمانی و نیاز به بهبود سیستم های بیانی در این سلول ها، مطالعه ای با هدف بهینه سازی سیستم بیان پروتئین های نوترکیب در سلول های CHO انجام شد. در این مطالعه، محققان به بررسی تاثیر افزودن توالی های تنظیمی کوزاک و رهبر به وکتورهای بیانی و همچنین حذف ژن آپوپتوزی Apaf1 در سلول های CHO پرداختند.

طراحی وکتورهای بیانی نوین

در این پژوهش، وکتورهای بیانی جدیدی طراحی و ساخته شدند که در آن ها توالی های تنظیمی کوزاک به تنهایی و همچنین ترکیب توالی های کوزاک و رهبر، در بالادست ژن گزارشگر eGFP قرار داده شدند. هدف از این کار، بررسی تاثیر این توالی های تنظیمی بر سطح بیان پروتئین eGFP بود.

افزایش بیان eGFP با توالی های تنظیمی

نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که افزودن توالی کوزاک به تنهایی و به ویژه ترکیب توالی های کوزاک و رهبر، به طور قابل توجهی شدت فلورسانس سبز eGFP را در سلول های CHO افزایش می دهد. این یافته ها حاکی از آن است که این توالی های تنظیمی می توانند به طور موثری کارایی ترجمه و سطح بیان پروتئین eGFP را در سلول های CHO بهبود بخشند.

تایید افزایش بیان با پروتئین های درمانی IL-3 و SEAP

به منظور تایید این یافته ها و بررسی تاثیر توالی های تنظیمی بر بیان پروتئین های درمانی، ژن eGFP با ژن های پروتئین های درمانی IL-3 و SEAP جایگزین شد. نتایج ترانسفکشن سلول های CHO-S با وکتورهای حاوی IL-3 و SEAP نیز نشان داد که افزودن توالی های تنظیمی کوزاک و رهبر، سطح بیان این پروتئین های درمانی را به طور قابل توجهی افزایش می دهد. این افزایش بیان، هم در شرایط بیان گذرا و هم در شرایط بیان پایدار مشاهده شد.

حذف ژن آپوپتوزی Apaf1 با استفاده از CRISPR/Cas9

در ادامه این مطالعه، محققان به منظور افزایش بقای سلولی و بهبود تولید پروتئین، به حذف ژن آپوپتوزی Apaf1 در سلول های CHO با استفاده از فناوری CRISPR/Cas9 پرداختند. آپوپتوز، یا مرگ برنامه ریزی شده سلولی، می تواند به کاهش بازده تولید پروتئین های نوترکیب منجر شود. حذف ژن های دخیل در آپوپتوز می تواند بقای سلولی را افزایش داده و در نتیجه، تولید پروتئین را بهبود بخشد.

ایجاد رده سلولی CHO با حذف Apaf1

با استفاده از سیستم CRISPR/Cas9، محققان موفق به ایجاد رده سلولی CHO با حذف ژن Apaf1 شدند. بررسی های توالی یابی، سطح mRNA و سطح پروتئین، حذف موفقیت آمیز ژن Apaf1 در این رده سلولی را تایید نمود.

بررسی اثر حذف Apaf1 بر خواص بیولوژیکی سلول های CHO

به منظور ارزیابی تاثیر حذف Apaf1 بر خواص بیولوژیکی سلول های CHO، سه کلون مونوکلونال (CHO-KO-1، CHO-KO-2 و CHO-KO-3) از رده سلولی حذف شده ایجاد و مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج نشان داد که حذف Apaf1 تاثیر معنی داری بر رشد سلولی ندارد. با این حال، بررسی میزان آپوپتوز با استفاده از فلوسیتومتری نشان داد که حذف ژن آپوپتوزی می تواند نسبت سلول های آپوپتوزی را کاهش دهد.

تایید حذف Apaf1 در سطح mRNA و پروتئین

نتایج توالی یابی نشان داد که در هر سه کلون مونوکلونال، جهش هایی در ژن Apaf1 رخ داده است که منجر به اختلال در عملکرد این ژن می شود. بررسی سطح mRNA نیز نشان داد که سطح رونویسی mRNA ژن Apaf1 در این سلول ها به طور قابل توجهی کاهش یافته است. در نهایت، بررسی سطح پروتئین Apaf1 نیز تایید نمود که سطح پروتئین Apaf1 در رده های سلولی حذف شده در مقایسه با سلول های CHO وحشی به طور قابل توجهی کاهش یافته است.

بهینه سازی سیستم بیان با ترکیب حذف Apaf1 و توالی های تنظیمی

به منظور دستیابی به حداکثر سطح بیان پروتئین، محققان سیستم بیان نوین CHO را با ترکیب رده سلولی CHO با حذف Apaf1 و وکتورهای بیانی بهینه سازی شده با توالی های تنظیمی ایجاد کردند. نتایج ترانسفکشن وکتورهای بیان eGFP، IL-3 و SEAP به سلول های CHO-WT و CHO-KO-3 نشان داد که سیستم بیان نوین CHO به طور قابل توجهی سطح بیان پروتئین را افزایش می دهد.

افزایش چشمگیر بیان پروتئین با سیستم بیان نوین

نتایج بهینه سازی اولیه نشان داد که وکتورهای حاوی توالی کوزاک و به ویژه ترکیب توالی های کوزاک و رهبر، در مقایسه با وکتور کنترل، بیان eGFP را به ترتیب 1.26 و 2.2 برابر افزایش می دهند. استفاده از سیستم بیان نوین CHO در سلول های CHO-KO نیز منجر به افزایش چشمگیر فلورسانس eGFP در مقایسه با سلول های CHO-WT شد.

تاثیر بهینه سازی وکتور بر بیان پروتئین های SEAP و IL-3

بررسی تاثیر بهینه سازی وکتور بر بیان پروتئین های SEAP و IL-3 نیز نتایج مشابهی را نشان داد. وکتورهای SEAP و IL-3 حاوی توالی های تنظیمی کوزاک و رهبر، بیان گذرا و پایدار این پروتئین ها را به طور قابل توجهی افزایش دادند. به طور خاص، وکتور SEAP با توالی ترکیبی کوزاک و رهبر و وکتور IL-3 با توالی کوزاک به تنهایی، بهترین عملکرد را در افزایش بیان این پروتئین ها نشان دادند.

ارتباط بین تعداد نسخه ژن و سطح بیان پروتئین

تجزیه و تحلیل تعداد نسخه ژن نشان داد که سطح بیان گذرا پروتئین های SEAP و IL-3 ارتباط نزدیکی با تعداد نسخه ژن ندارد. با این حال، در شرایط بیان پایدار، با افزایش سطح بیان پروتئین، تعداد نسخه ژن نیز افزایش می یابد. این یافته ها حاکی از آن است که در بیان پایدار، سطح بیان پروتئین در سلول های CHO-KO به تعداد نسخه ژن وابسته است، در حالی که در بیان گذرا، عوامل دیگری غیر از تعداد نسخه ژن در افزایش بیان پروتئین نقش دارند.

بحث و نتیجه گیری: دستیابی به سیستم بیان نوین و کارآمد

مطالعه حاضر، با هدف بهینه سازی سیستم بیان پروتئین های نوترکیب در سلول های CHO، به نتایج ارزشمندی دست یافته است. محققان نشان دادند که افزودن توالی های تنظیمی کوزاک و رهبر به وکتورهای بیانی و حذف ژن آپوپتوزی Apaf1 در سلول های CHO، می تواند به طور موثری سطح بیان پروتئین های نوترکیب را افزایش دهد.

استراتژی های موثر برای بهبود بیان پروتئین

نتایج این پژوهش، استراتژی های موثری را برای بهبود بیان پروتئین های نوترکیب در سلول های CHO ارائه می دهد. بهینه سازی توالی های تنظیمی و اصلاح رده های سلولی، دو رویکرد کلیدی برای دستیابی به سیستم های بیانی با بازده بالا به شمار می روند. انتخاب استراتژی بهینه سازی وکتور می تواند بسته به نوع پروتئین هدف متفاوت باشد. برای پروتئین SEAP، استفاده از توالی ترکیبی کوزاک و رهبر در بالادست ژن توصیه می شود، در حالی که برای پروتئین IL-3، افزودن توالی کوزاک به تنهایی کافی به نظر می رسد.

کاربردهای سیستم بیان نوین CHO

سیستم بیان نوین CHO ایجاد شده در این مطالعه، پتانسیل بالایی برای تولید پروتئین های نوترکیب، به ویژه پروتئین های درمانی، در مقیاس بزرگ دارد. این سیستم می تواند به ویژه در بیان پروتئین های دشوار بیان که با سیستم های بیانی رایج به خوبی بیان نمی شوند، کاربرد داشته باشد.

آینده پژوهش

در مطالعات آینده، محققان می توانند از سیستم بیان نوین CHO برای بیان انواع مختلف پروتئین های دشوار بیان استفاده کرده و کارایی این سیستم را در تولید پروتئین های درمانی مختلف مورد ارزیابی قرار دهند. این پژوهش می تواند گامی مهم در جهت توسعه روش های کارآمدتر و مقرون به صرفه تر برای تولید داروهای زیستی نوترکیب باشد.

منبع :

Optimization of a novel expression system for recombinant protein production in CHO cells