آیا در استخراج RNA با ترایزول به مشکل برخوردهاید؟ نگران نباشید، تنها نیستید!
استخراج RNA با استفاده از ترایزول یک روش قدرتمند و پرکاربرد در آزمایشگاههای زیستشناسی مولکولی است، اما گاهی اوقات ممکن است با چالشهایی روبرو شوید. این روش، با بهرهگیری از فنل و ایزوتیوسیانات گوانیدین، سلولها را به سرعت لیز کرده و فعالیت آنزیمهای RNase را مهار میکند تا RNA شما سالم بماند.
پس از افزودن کلروفرم و سانتریفیوژ، مخلوط به سه فاز تقسیم میشود:
- فاز آبی بالایی: حاوی RNA.
- فاز میانی: حاوی DNA.
- فاز آلی پایینی: حاوی پروتئینها.
در ادامه، به برخی از رایجترین مشکلاتی که ممکن است در این فرآیند با آنها مواجه شوید، میپردازیم و راهحلهای عملی ارائه میدهیم.
مشکل ۱: کدر بودن ترایزول در یخچال
گاهی اوقات ممکن است ترایزول را از یخچال بیرون بیاورید و ببینید که کمی کدر است. این موضوع معمولاً طبیعی است. علت: ترایزول حاوی ترکیبات آلی مانند فنل است که در دماهای پایین ممکن است کدر شوند. اگر بطری در قسمتهای سردتر یخچال (نزدیک به دیواره پشتی) نگهداری شود، این پدیده بیشتر رخ میدهد. راهحل: بطری را در دمای اتاق قرار دهید تا شفاف شود. برای جلوگیری از این مشکل، آن را در قسمتی از یخچال که دمای پایدارتری دارد (مانند درب یخچال) نگهداری کنید.
مشکل ۲: باقی ماندن مواد نامحلول پس از همگنسازی
بعد از همگنسازی نمونه با TRIzol، ممکن است ذراتی را ببینید که حل نشدهاند. اینها معمولاً بقایای سلول یا بافت هستند. علت: این ذرات میتوانند بازدهی استخراج RNA را کاهش دهند. راهحل: قبل از افزودن کلروفرم، نمونه را به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد و با سرعت ۱۲,۰۰۰g سانتریفیوژ کنید. سپس فاز شفاف بالایی را به یک لوله جدید منتقل کرده و ادامه دهید.
مشکل ۳: تغییر رنگ فاز آبی
فاز آبی باید شفاف و بیرنگ باشد، اما گاهی اوقات ممکن است رنگهای غیرعادی مانند زرد، صورتی یا قهوهای به خود بگیرد. علت: این مشکل میتواند ناشی از نوع نمونه باشد:
- بافتهای پوستی: حاوی چربی و ملانین هستند که میتوانند باعث رنگی شدن فاز آبی شوند.
- نمونههای خونی: هموگلوبین موجود در خون میتواند فاز آبی را زرد یا کدر کند.
- حجم ناکافی TRIzol: اگر نسبت نمونه به TRIzol کم باشد، جداسازی فازها زودتر اتفاق میافتد و ممکن است رنگهای غیرعادی مشاهده شود. راهحل:
- برای نمونههای پوستی: قبل از افزودن کلروفرم، نمونه همگن شده را سانتریفیوژ کنید تا لایه چربی از بین برود.
- برای نمونههای خونی: نمونهها را قبل از استخراج با PBS بشویید تا آلودگی خون کاهش یابد.
- برای حجم کم TRIzol: حجم بیشتری از TRIzol اضافه کنید.
مشکل ۴: تشکیل نشدن لایه میانی سفید
لایه میانی سفید رنگی که پس از سانتریفیوژ تشکیل میشود، حاوی DNA و پروتئینها است. اگر این لایه تشکیل نشود، ممکن است استخراج شما موفق نبوده باشد. علت:
- مخلوط کردن ناکافی: پس از افزودن کلروفرم، مخلوط باید به خوبی ورتکس شود تا شیری رنگ شود. اگر شفاف باقی ماند، دوباره مخلوط کنید.
- مقدار کم نمونه: در نمونههای با مقدار کم، لایه میانی ممکن است بسیار نازک یا نامرئی باشد. راهحل:
- مخلوط را به خوبی ورتکس کنید.
- در نمونههای با مقدار کم، با احتیاط کار را ادامه دهید یا از یک حامل (مانند گلیکوژن) برای افزایش بازدهی رسوبگذاری RNA استفاده کنید.
مشکل ۵: رسوب در ته لوله قبل از افزودن ایزوپروپانول
گاهی ممکن است قبل از افزودن ایزوپروپانول، رسوبات نامطلوبی در ته لوله مشاهده کنید. علت: این رسوبات معمولاً پلیساکاریدها یا بقایای غشای سلولی هستند. در نمونههایی مانند کبد، یک لایه چسبنده قرمز نیز ممکن است تشکیل شود. راهحل: این لایهها باید دور ریخته شوند و فقط فاز آبی بالایی را برای ادامه کار استفاده کنید.
مشکل ۶: رنگ یا بافت غیرطبیعی پلت RNA
پلت RNA معمولاً شفاف و سفید است. اگر رنگی (مانند قهوهای یا خاکستری) یا بافتی ژلاتینی داشته باشد، نشاندهنده آلودگی است. علت:
- ترکیب نمونه: نمونههایی مانند حشرات یا بافتهای گیاهی حاوی پلیساکاریدها یا پلیفنلها هستند که میتوانند باعث ایجاد رسوبات رنگی شوند.
- خطای عملیاتی: کشیدن تصادفی لایه میانی یا آلی میتواند باعث آلودگی RNA شود. راهحل:
- برای نمونههای خاص: مقدار نمونه ورودی را کاهش دهید یا از کیتهای مخصوص استفاده کنید.
- برای آلودگی: فاز آبی را دوباره با کلروفرم استخراج کنید.
مشکل ۷: دیده نشدن پلت RNA
این مشکل معمولاً در نمونههایی با مقدار کم RNA رخ میدهد. علت:
- محتوای کم RNA: اگر مقدار RNA نمونه کم باشد، پلت آن ممکن است نامرئی باشد.
- شستشوی نامناسب با اتانول: اگر غلظت اتانول برای شستشو کم باشد، RNA ممکن است در آن حل شده و از بین برود. راهحل:
- بعد از افزودن ایزوپروپانول، به مدت ۱۰ تا ۳۰ دقیقه در دمای ۴- یا ۲۰- درجه سانتیگراد رسوبگذاری کنید.
- حتی اگر پلتی دیده نشد، با احتیاط مایع رویی را با پیپت بردارید.
- از یک حامل مانند گلیکوژن برای بهبود بازدهی استفاده کنید.
با شناخت این مشکلات و راهحلهای آنها، میتوانید فرآیند استخراج RNA خود را بهینه کرده و نتایج دقیقتری کسب کنید.
محصول ترایزول ما را برای تجربه یک استخراج بیدردسر مشاهده کنید.
#ترایزول #استخراج-RNA