گشودن پتانسیل ویرایش ژنوم: چگونه SpRY-Cas9 بر محدودیت‌های PAM غلبه می‌کند

CRISPR-Cas9 با قادر ساختن تغییرات دقیق DNA، انقلابی در ویرایش ژنوم ایجاد کرده است. با این حال، کاربرد آن مدت‌هاست که به دلیل نیاز به یک موتیف DNA خاص به نام موتیف مجاور پروتواسپیسر (PAM)، که معمولاً توالی “NGG” است، محدود شده بود. این محدودیت، تعداد مکان‌های ژنومی قابل هدف‌گیری را محدود می‌کند. پیشرفت‌های اخیر در مهندسی پروتئین منجر به توسعه SpRY-Cas9، یک نوع تقریباً بدون PAM شده است که به طور چشمگیری دامنه توالی‌های قابل ویرایش را گسترش می‌دهد. یک مطالعه پیشگامانه که در مجله Nature Communications توسط هیبشمن و همکاران (2024) منتشر شده است، مکانیسم‌های مولکولی پشت توانایی منحصر به فرد SpRY برای بررسی DNA بدون وابستگی سختگیرانه به PAM را آشکار می‌کند. این تحقیق نه تنها درک ما از سیستم‌های CRISPR را ارتقا می‌بخشد، بلکه راه را برای نسل بعدی ابزارهای ویرایش ژنوم با تطبیق‌پذیری بی‌سابقه هموار می‌کند.

مشکل PAM و نوید SpRY-Cas9

نقش PAM در CRISPR-Cas9 :CRISPR-Cas9 اهداف DNA را از طریق جفت‌شدن بازهای مکمل بین یک RNA راهنما (gRNA) و DNA هدف شناسایی می‌کند. با این حال، Cas9 ابتدا به یک توالی PAM کوتاه در مجاورت محل هدف برای شروع باز کردن و برش DNA نیاز دارد. در استرپتوکوکوس پیوژنز (Cas9 )رایج‌ترین نوع مورد استفاده PAM، “NGG” است. این توالی به عنوان یک “پرچم” مولکولی برای تشخیص DNA خودی باکتری از ویروس‌های مهاجم عمل می‌کند، اما مناطق قابل ویرایش در ژنوم‌های یوکاریوتی را نیز محدود می‌کند. تقریباً از هر 16 توالی DNA تصادفی، یکی حاوی PAM NGG است و بسیاری از ژن‌های مرتبط با بیماری را برای ویرایش غیرقابل دسترس می‌گذارد.

ورود: SpRY-Cas9 یک ویرایشگر تقریباً بدون PAM که از طریق جهش در دامنه تعامل‌کننده با PAM (PI) در Cas9 مهندسی شده است، این محدودیت را برطرف می‌کند و امکان هدف‌گیری تقریباً هر توالی DNA را فراهم می‌آورد. در حالی که دامنه هدف‌گیری گسترده‌تر SpRY تحول‌آفرین است، مکانیسم‌های زیربنایی فعالیت بدون PAM آن همچنان نامشخص بود. SpRY چگونه توالی‌های متنوع را بدون قربانی کردن اختصاصیت تشخیص می‌دهد؟ کارایی آن در مقایسه با Cas9 سنتی چگونه است؟ این مطالعه از طریق یک رویکرد چند رشته‌ای که ترکیبی از میکروسکوپ الکترونی کرایو (cryo-EM)، تصویربرداری تک مولکولی و تجزیه و تحلیل سینتیکی است، به این سوالات پاسخ می‌دهد.

مکانیسم‌های تشخیص DNA بدون PAM

انعطاف‌پذیری ساختاری در دامنه تعامل‌کننده با :PAM تیم تحقیقاتی ساختارهای cryo-EM از SpRY متصل به بسترهای DNA با توالی‌های PAM متنوع( NGG، NAC و NTC) را تعیین کردند. برخلاف Cas9 وحشی که PAM NGG را از طریق پیوندهای هیدروژنی تشخیص می‌دهد، دامنه PI جهش‌یافته SpRY، ساختارهای انعطاف‌پذیری را برای تطبیق با PAM‌های مختلف اتخاذ می‌کند. جهش‌های کلیدی )به عنوان مثال، R1333P و (R1335Q تعاملات ویژه بازها را حذف می‌کنند، در حالی که سایر جهش‌ها )به عنوان مثال، G1218K و( T1337R یک سطح با بار مثبت ایجاد می‌کنند که تعاملات الکترواستاتیک غیر اختصاصی با اسکلت قندی-فسفاتی DNA را تثبیت می‌کند. این “لنگر انداختن الکترواستاتیک” به SpRY اجازه می‌دهد تا به طور محکم به DNA متصل شود، حتی در مکان‌های خارج از هدف.

جابجایی اسکلت قندی-فسفاتی DNA و سازگاری ساختاری: SpRY در مقایسه با Cas9، یک جابجایی 5 آنگسترومی در اسکلت قندی-فسفاتی DNA ایجاد می‌کند که توسط جهش‌های D1135L) و (S1136W که در شیار کوچک DNA قرار می‌گیرند، تسهیل می‌شود. این تغییرات ساختاری SpRY را قادر می‌سازد تا DNA را خم کرده و بدون تکیه بر یک PAM خاص، آن را بررسی کند. علاوه بر این، جهش‌هایی مانند N1317R و A1322R با اسکلت قندی-فسفاتی رشته غیر هدف (NTS) جابجا شده تعامل می‌کنند و باعث ذوب اولیه DNA می‌شوند – یک مرحله حیاتی در تشکیل R-loop.

مبادله: هدف‌گیری گسترده در مقابل کارایی

سینتیک کندتر برش DNA : در حالی که انعطاف‌پذیری SpRY به آن اجازه می‌دهد تا به توالی‌های متنوع متصل شود، این امر هزینه‌ای دارد. آزمایش‌های سینتیکی نشان داد که SpRY ، DNA را حدود 500 برابر کندتر از Cas9 برش می‌دهد. به عنوان مثال، سرعت برش رشته هدف (TS) توسط 0.0025 s⁻¹ SpRY است، در حالی که این مقدار برای 1.4 s⁻¹ Cas9 است. این کندی به انتشار ناکارآمد R-loop نسبت داده می‌شود – فرآیندی که در آن gRNA با DNA جفت می‌شود تا یک دورشته هیبریدی تشکیل دهد. آزمایش‌های جریان متوقف نشان داد که SpRY ، DNA را با سرعت 0.046-0.004 s⁻¹ باز می‌کند که 3 تا 10 برابر کندتر از Cas9 است.

تصویرسازی واسطه‌های R-Loop سینتیک کند به تیم اجازه داد تا ساختارهای cryo-EM از SpRY در حال عمل را ثبت کنند. با تهیه نمونه‌ها در نقاط زمانی خاص، آنها هفت حالت واسطه تشکیل R-loop (0، 2، 3، 10، 13، 18 و 20 جفت باز) را مشخص کردند. این ساختارها نشان دادند:

بررسی اولیه DNA: SpRY را 50 درجه خم می‌کند و باعث باز شدن آن می‌شود.

جفت شدن ناحیه :seed یک هیبرید RNA-DNA جفت بازی باعث جابجایی دامنه REC2 می‌شود، یک نقطه بازرسی برای پیشرفت R-loop.

تغییرات ساختاری: دامنه‌های REC2 و REC3 به طور چشمگیری جابجا می‌شوند تا R-loop در حال رشد را در خود جای دهند.

حالت پیش کاتالیزوری: در 18 جفت باز، دامنه نوکلئاز HNH به محل برش نزدیک می‌شود اما فعال‌سازی کاتالیزوری کامل را ندارد.

اتصال خارج از هدف: آزمایشات نشان داد که SpRY به طور غیر اختصاصی در سراسر مولکول‌های DNA متصل می‌شود و در مکان‌های خارج از هدف با مکمل جزئی باقی می‌ماند. در حالی که Cas9 به سرعت از توالی‌های ناسازگار جدا می‌شود، SpRY به طور پایدار متصل می‌ماند (نیمه‌عمر حدود 260 ثانیه در مقابل حدود 170 ثانیه برای (Cas9 این اتصال طولانی‌تر، جستجوی هدف را کند می‌کند اما با جلوگیری از فعال شدن نوکلئاز در مکان‌های ناسازگار، برش خارج از هدف را کاهش می‌دهد.

SpG-Cas9 :پلی بین Cas9 و SpRY

SpG-Cas9، یک نوع واسطه با ترجیح PAM NGN، شش جهش مشترک با SpRY دارد. تجزیه و تحلیل ساختاری و سینتیکی نشان داد که SpG تعاملات ویژه بازها (از طریق( R1333 را با تماس‌های الکترواستاتیک غیر اختصاصی ترکیب می‌کند و امکان تشخیص تمام PAM‌های NGN را در عین حفظ کارایی برش بالاتر نسبت به SpRY فراهم می‌کند. به عنوان مثال، DNA SpG را حدود 20 برابر سریع‌تر از SpRY برش می‌دهد اما همچنان کندتر از Cas9 وحشی است. این امر SpG را به عنوان یک گزینه متعادل برای کاربردهایی که به انعطاف‌پذیری متوسط PAM و فعالیت بالاتر نیاز دارند، قرار می‌دهد.

پیامدهای ویرایش ژنوم و بیوتکنولوژی

گسترش ژنوم قابل ویرایش: فعالیت تقریباً بدون SpRY PAM ، مناطق ژنومی غیرقابل دسترس را باز می‌کند و فرصت‌های جدیدی را برای هدف قرار دادن جهش‌ها در عناصر تنظیمی غیرکدکننده، توالی‌های تکراری و مناطق غنی از GC ارائه می‌دهد. این امر می‌تواند درمان بیماری‌های ناشی از جهش در مناطق بدون PAM را پیشرفت بخشد.

ایجاد تعادل بین اختصاصیت و کارایی: این مطالعه یک مبادله کلیدی را برجسته می‌کند: هدف‌گیری گسترده‌تر، سرعت برش را کاهش می‌دهد. با این حال، اتصال پایدار خارج از هدف SpRY ممکن است به طور متناقضی با جلوگیری از برش در مکان‌های ناسازگار، اختصاصیت را افزایش دهد. برای کاربردهای درمانی، این جستجوی کندتر و سنجیده‌تر می‌تواند ویرایش‌های ناخواسته را کاهش دهد.

مهندسی ویرایشگرهای نسل بعدی بینش‌های ساختاری و سینتیکی حاصل از این کار، یک نقشه راه برای بهینه‌سازی سیستم‌های CRISPR فراهم می‌کند. به عنوان مثال:

جهش‌یافته‌های فوق فعال: ترکیب انعطاف‌پذیری SpRY با جهش‌هایی که تشکیل R-loop را تسریع می‌کنند، می‌تواند کارایی را بهبود بخشد.

سیستم‌های کایمریک: ادغام دامنه SpRY PI با سایر انواع Cas ممکن است ویرایشگرهایی با ترجیحات PAM سفارشی ایجاد کند.

هدف‌گیری خاص بافت: ترجیح SpRY برای DNA با قابلیت ذوب آسان (به عنوان مثال، در کروماتین باز) می‌تواند برای ویرایش خاص نوع سلول مورد استفاده قرار گیرد.

نتیجه‌گیری: به سوی ویرایش دقیق ژنوم

مطالعه هیبشمن و همکاران نشان دهنده یک جهش بزرگ در درک چگونگی مهندسی سیستم‌های CRISPR برای فراتر رفتن از محدودیت‌های طبیعی است. این تحقیق با روشن ساختن انعطاف‌پذیری ساختاری SpRY، رفتار اتصال خارج از هدف و تنگناهای سینتیکی، زمینه را برای طراحی ویرایشگرهای ژنوم ایمن‌تر و متنوع‌تر فراهم می‌کند. در حالی که چالش‌هایی مانند بهبود کارایی SpRY باقی مانده است، این کار بر قدرت ادغام زیست‌شناسی ساختاری، بیوشیمی و تکنیک‌های تک مولکولی برای تشریح مکانیسم‌های مولکولی پیچیده تأکید می‌کند.

برای شرکت‌های فعال در زمینه ویرایش ژنوم، این یافته‌ها امکانات هیجان‌انگیزی را باز می‌کنند:

توسعه درمان: هدف قرار دادن جهش‌های قبلاً “غیرقابل درمان”.

ابزارهای تشخیصی: مهندسی پروب‌های با دقت بالا برای تشخیص DNA.

بیوتکنولوژی کشاورزی: ویرایش ژنوم محصولات کشاورزی با انعطاف‌پذیری بیشتر.

همانطور که فناوری CRISPR به تکامل خود ادامه می‌دهد، SpRY-Cas9 و مشتقات آن نقش محوری در شکل دادن به آینده مهندسی ژنتیک ایفا خواهند کرد.

نکات کلیدی

SpRY-Cas9 از طریق انعطاف‌پذیری ساختاری و تعاملات غیر اختصاصی DNA بر محدودیت‌های PAM غلبه می‌کند.

مبادله‌ها: سینتیک برش کندتر اما فعالیت خارج از هدف کاهش یافته است.

بینش‌های ساختاری: Cryo-EM حالات واسطه R-loop را ثبت می‌کند و مهندسی آینده را هدایت می‌کند.

SpG-Cas9 با تشخیص PAM NGN و کارایی بالاتر، یک حد وسط را ارائه می‌دهد.

کاربردها: دامنه هدف‌گیری گسترده‌تر برای نوآوری‌های درمانی، تشخیصی و کشاورزی.

این تحقیق نه تنها زیست‌شناسی CRISPR را پیشرفت می‌بخشد، بلکه نمونه‌ای از چگونگی پیشبرد نوآوری‌های بیوتکنولوژیک توسط رویکردهای بین رشته‌ای است.

منبع :Unraveling the mechanisms of PAMless DNA interrogation by SpRY-Cas9