درک پتانسیل زهر عقرب: تعیین ویژگیهای بیوشیمیایی و بررسی فعالیت PLA2 نوترکیب از Hemiscorpius lepturus
زهر عقرب مدتهاست که به دلیل ترکیبات فعال زیستی قوی خود، که بسیاری از آنها پتانسیل نوآوریهای پزشکی را دارند، توجه دانشمندان را به خود جلب کرده است. در میان گونههای کشندهتر، Hemiscorpius lepturus، عقربی است که عمدتاً در استان خوزستان ایران یافت میشود. اگرچه این گونه مسئول تنها 15 درصد از گزشهای عقرب در ایران است، اما زهر آن عامل 95 درصد از مرگهای ناشی از عقرب گزیدگی است. خطرناک بودن زهر آن به این دلیل است که گزش اولیه آن تقریباً بدون درد است و در نتیجه مداخله پزشکی به تأخیر میافتد.
در قلب سمیت زهر آن خانوادهای از آنزیمها به نام فسفولیپازها، به ویژه فسفولیپاز A2 (PLA2)، قرار دارند. با این حال، علیرغم نقش حیاتی آنها در مسمومیت، ساختار و عملکرد PLA2های مشتق از عقربها نسبتاً ناشناخته باقی مانده است.
این گزارش بر اساس مطالعه ای که هدف آن پر کردن این شکاف دانش از طریق کلونینگ، بیان، خالصسازی و تعیین ویژگیهای PLA2 نوترکیب از H. lepturus در اشریشیا کلی و ارزیابی فعالیت و پتانسیل ایمنیزایی آن بود ، انجام شده است.
اهداف مطالعه
اهداف اصلی این مطالعه عبارت بودند از:
کلونینگ و بیان ژن PLA2 از زهر H. lepturus در E. coli.
خالصسازی پروتئین PLA2 نوترکیب.
تعیین ویژگیهای بیوشیمیایی و ساختاری آن.
ارزیابی فعالیت آنزیمی آن در شرایط مختلف.
بررسی توانایی آن در القای تولید آنتیبادی در خرگوشها.
هدف گستردهتر؟ فراهم کردن مبنایی برای توسعه پادزهرهای هدفمند و حتی عوامل درمانی، کاهش وابستگی به استخراج کل زهر و کمک به حفظ جمعیت عقربها.
کلونینگ مولکولی، بیان و خالصسازی
ژن PLA2 با موفقیت در وکتور pET-26b(+) کلون و در E. coli BL21 (DE3) pLysS بیان شد و پروتئینی با وزن مولکولی تقریباً 14 کیلو دالتون به دست آمد.
خالصسازی با استفاده از ستون کروماتوگرافی افینیتی Ni-NTA انجام شد و هویت آن از طریق وسترن بلاتینگ با استفاده از آنتیبادیهای ضد His تأیید شد.
این روش بازده و خلوص بالایی از PLA2 را تضمین کرد و بر چالشهای رایج بیان پروتئینهای زهر در سیستمهای باکتریایی غلبه کرد.
تعیین ویژگیهای ساختاری
محققان با استفاده از طیفسنجی دورنگ نمایی دایروی (CD)، ساختار ثانویه PLA2 نوترکیب را تعیین کردند:
45.1% بتا-شیت
36.6% رندوم کویل (حلقه تصادفی)
10.3% پیچش
8.1% آلفا-هلیکس
این ترکیب ساختاری غنی از بتا-شیت و رندوم کویل را نشان میدهد، پیکربندی که اغلب با ثبات و انعطافپذیری عملکردی در پروتئینهای زهر مرتبط است.
حفظ این ساختارها بسیار مهم بود، به ویژه از آنجایی که پروتئین پس از خالصسازی (به دلیل دناتوراسیون اولیه با اوره) باید دوباره تا میخورد.
فعالیت آنزیمی
فعالیت فسفولیپازی با اندازهگیری هیدرولیز لسیتین ارزیابی شد.
یافتههای کلیدی
PLA2 در مقایسه با زهر خام، زمانی که غلظت نرمالسازی شد، فعالیت آنزیمی بالاتری نشان داد.
اوج فعالیت فسفولیپازی در غلظت 6.25 میکروگرم در میلیلیتر مشاهده شد.
فعالیت وابسته به دما بود، به طوری که بالاترین فعالیت در دمای 25 درجه سانتیگراد (بیش از 70%) و کاهش به حدود 62% در دمای 37 درجه سانتیگراد مشاهده شد. فعالیت در دماهای بالاتر از 70 درجه سانتیگراد به طور کامل از بین رفت، که احتمالاً به دلیل دناتوراسیون حرارتی بود.
این یافتهها برای طراحی فرمولاسیونهای درمانی، جایی که پایداری آنزیم در دماهای فیزیولوژیکی حیاتی است، ضروری هستند.
خواص ضد باکتریایی
جالب توجه است که PLA2 نوترکیب فعالیت ضد باکتریایی قوی نشان داد:
حداقل غلظت مهارکننده (MIC): 31.25 میکروگرم در میلیلیتر
حداقل غلظت کشنده باکتری (MBC): 0.5 میلیگرم در میلیلیتر
در این غلظتها، PLA2 تمام باکتریهای آزمایششده را مهار و از بین برد، که پتانسیل آن را به عنوان یک عامل ضد میکروبی آینده، به ویژه در عصر افزایش مقاومت آنتیبیوتیکی، برجسته میکند.
مطالعات ایمنیزایی
برای تعیین اینکه آیا PLA2 میتواند پاسخ ایمنی ایجاد کند یا خیر، خرگوشهای سفید نژاد نیوزیلندی با پروتئین نوترکیب در پنج نوبت با فاصله 10 تا 12 روز ایمنسازی شدند.
با استفاده از روش ELISA، این مطالعه نشان داد:
افزایش تدریجی و پیوسته در آنتیبادیهای ضد PLA2 پس از هر تزریق.
رسیدن سطح آنتیبادی به اوج پس از تزریق پنجم.
این نشان داد که PLA2 بسیار ایمنیزا است – یک ویژگی حیاتی برای توسعه پادزهرهای هدفمند.
بحث و پیامدها
بیان و خالصسازی موفقیتآمیز PLA2 در E. coli راه را برای تحقیقات و کاربردهای پزشکی متعدد باز میکند.
نکات برجسته کلیدی
تولید پادزهر: آنتیبادیهای اختصاصی علیه PLA2 میتوانند منجر به پادزهرهای مؤثرتر و ایمنتر شوند و خطر واکنشهای آلرژیک رایج در آنتیسرمهای فعلی مشتق از زهر کامل را به حداقل برسانند.
توسعه دارو: خواص ضد باکتریایی PLA2 پتانسیل درمانهای ضد میکروبی جدید را نشان میدهد.
تحقیقات سرطان: مطالعات دیگر نشان دادهاند که برخی از مهارکنندههای فسفولیپاز میتوانند سلولهای سرطانی را نسبت به فروپتوز (نوعی مرگ سلولی برنامهریزیشده) حساس کنند، که به نقشهای درمانی گستردهتر برای مولکولهای مشتق از PLA2 اشاره دارد.
این مطالعه همچنین بر اهمیت فناوریهای نوترکیب مدرن برای جایگزینی روشهای سنتی استخراج زهر تأکید میکند. این نه تنها پایدارتر بلکه از نظر اخلاقی نیز بهتر خواهد بود و از آسیب رساندن به جمعیت عقربها جلوگیری میکند و در عین حال منبع قابل اعتمادی از اجزای زهر را برای تحقیقات و استفاده درمانی تضمین میکند.
چالشها و مسیرهای آینده
در حالی که این مطالعه پیشرفتهای چشمگیری داشته است، چند چالش باقی مانده است:
پایداری پروتئین: کاهش فعالیت PLA2 در دماهای فیزیولوژیکی (37 درجه سانتیگراد) نشاندهنده نیاز به بهینهسازی بیشتر برای کاربردهای درمانی است.
حساسیت به pH: تغییرات در pH بر آزمایشهای رنگسنجی تأثیر گذاشت و اندازهگیری برخی از فعالیتها را پیچیده کرد – اصلاح روشهای آزمایش ضروری است.
اثربخشی درونتنی: مطالعات آینده باید اثرات محافظتی آنتیبادیهای PLA2 نوترکیب را در مدلهای مسمومیت واقعی ارزیابی کنند.
تحقیقات بیشتر احتمالاً به بررسی موارد زیر خواهد پرداخت:
استفاده از PLA2 نوترکیب به عنوان کاندید واکسن.
ترکیب PLA2 با سایر اجزای زهر برای تولید پادزهرهای با طیف وسیعتر.
بررسی دقیقتر پتانسیل ضد سرطانی PLA2.
نتیجهگیری
این مطالعه برجسته با موفقیت PLA2 نوترکیب از زهر Hemiscorpius lepturus را کلون، بیان، خالصسازی و تعیین ویژگیهای آن کرد و فعالیت آنزیمی قوی، خواص ضد باکتریایی و پتانسیل ایمنیزایی آن را نشان داد.
نتایج آن راه را برای تولید نسل بعدی پادزهرها، درمانهای جدید و درک عمیقتر بیوشیمی زهر عقرب هموار میکند.
مهمتر از همه، این مطالعه نشان میدهد که چگونه فناوری نوترکیب میتواند تحقیقات زهر را متحول کند – ترویج پایداری، شیوههای اخلاقی و نوآوری در علوم زیستپزشکی.
در زمانی که نیاز فوری به آنتیبیوتیکهای جدید و درمانهای پیشرفته وجود دارد، کشفاتی مانند این، پتانسیل باورنکردنی و دستنخوردهای را که در خطرناکترین موجودات طبیعت پنهان است، برجسته میکند.
منبع :
Biochemical characterization and activity profiling of recombinant phospholipase A2 from Hemiscorpius lepturus expressed in E. coli with in vivo antibody response