باکتری‌های جنس Streptomyces به عنوان کارخانه‌های میکروبی ارزشمند در تولید محصولات طبیعی با اهمیت بالینی و صنعتی شناخته می‌شوند. این باکتری‌ها، به ویژه به دلیل توانایی‌شان در تولید آنتی‌بیوتیک‌ها، ضد قارچ‌ها، داروهای ضد سرطان و سایر ترکیبات دارویی، مورد توجه فراوانی قرار گرفته‌اند. با این حال، ویرایش ژنوم این باکتری‌ها به دلیل محتوای بالای گوانین-سیتوزین (GC) در ژنوم آن‌ها، با چالش‌هایی روبرو است. سیستم CRISPR-Cas، به عنوان یک ابزار قدرتمند ویرایش ژنوم، در این باکتری‌ها به دلیل احتمال بالای اتصال و برش خارج از هدف (off-target) توسط Cas9، کارایی محدودی دارد. این اتصال‌های خارج از هدف، به دلیل فراوانی توالی‌های PAM تکراری یا مشابه در ژنوم‌های با محتوای GC بالا، افزایش می‌یابد و دقت ویرایش را کاهش می‌دهد.

برای کاهش برش‌های خارج از هدف ناشی از Cas9، استراتژی‌های مختلفی از جمله کاهش بیان Cas9، بیان پروتئین‌های مهارکننده و ایجاد جهش در محل اتصال Cas9 به DNA هدف، مورد بررسی قرار گرفته‌اند. در یک مطالعه نوآورانه، یک استراتژی جدید با هدف بهبود دقت ویرایش ژنوم در Streptomyces پیشنهاد شده است. این استراتژی، شامل اتصال زنجیره‌های پلی‌آسپارتات به پروتئین Cas9 است. این زنجیره‌های با بار منفی، مشابه پروتئین ضد CRISPR (AcrIIA4)، انتظار می‌رود که با برهمکنش با باقی‌مانده‌های بار مثبت در محل اتصال Cas9، مانع از اتصال بین پروتئین Cas9 و DNA هدف شوند.

این گزارش تخصصی به بررسی این مطالعه جدید می‌پردازد که به توسعه و کاربرد یک نوع مهندسی‌شده از سیستم CRISPR-Cas9، موسوم به Cas9-BD، برای ویرایش ژنوم Streptomyces با هدف بهبود تولید متابولیت‌های تخصصی می‌پردازد. این گزارش، مکانیسم عمل Cas9-BD، کارایی آن در کاهش برش‌های خارج از هدف، کاربردهای آن در مهندسی ژنتیک Streptomyces و پتانسیل آن در تسریع تحقیقات متابولیت‌های ثانویه را مورد بررسی قرار می‌دهد.

توسعه Cas9-BD با کارایی برش خارج از هدف کاهش یافته

استراتژی اتصال پلی‌آسپارتات به Cas9، با الهام از مکانیسم عمل پروتئین ضد CRISPR، AcrIIA4، طراحی شده است. AcrIIA4 با اتصال به ناحیه اتصال DNA پروتئین Cas9 و ممانعت از اتصال آن به DNA هدف، فعالیت Cas9 را مهار می‌کند. مشخص شده است که باقی‌مانده‌های آسپارتیل در AcrIIA4 نقش کلیدی در برهمکنش با ناحیه اتصال DNA پروتئین Cas9 ایفا می‌کنند. بر این اساس، محققان فرض کردند که افزودن باقی‌مانده‌های آسپارتیل به Cas9 می‌تواند اثر مشابهی داشته باشد و نیاز به بیان زمان‌بندی‌شده پروتئین مهارکننده را از بین ببرد.

انتظار می‌رفت که افزودن زنجیره‌های آسپارتیل به Cas9، به دلیل تفاوت در قدرت اتصال Cas9 به DNA هدف و DNA خارج از هدف، به طور انتخابی اتصال ضعیف Cas9 به DNA خارج از هدف را بیشتر از اتصال قوی آن به DNA هدف مهار کند. برای آزمایش این فرضیه، پروتئین Cas9 با پنج باقی‌مانده آسپارتیل به انتهای C و/یا N آن متصل شد. پروتئین Cas9 حاصل، Cas9-BD (Cas9-Binding Domain) نامیده شد.

نتایج آزمایش‌ها نشان داد که Cas9-BD در مقایسه با Cas9 وحشی (wild-type)، برش خارج از هدف بسیار کمتری را نشان می‌دهد. به طور خاص، Cas9-ND (Cas9 با زنجیره آسپارتیل متصل به انتهای N) کارایی برش خارج از هدف به مراتب پایین‌تری نسبت به Cas9-CD (Cas9 با زنجیره آسپارتیل متصل به انتهای C) نشان داد. این امر احتمالاً به دلیل نزدیکی ناحیه اتصال DNA به انتهای N پروتئین Cas9 است. در مجموع، Cas9-BD کمترین کارایی برش خارج از هدف را نشان داد، در حالی که کارایی برش در هدف آن مشابه Cas9 وحشی بود.

این اصلاح پروتئینی، انتظار می‌رود که برای انواع مختلف ابزارهای مبتنی بر Cas9، مانند BEST و پرایم ادیتینگ، برای کاهش برش‌های خارج از هدف قابل استفاده باشد. سمیت کاهش یافته Cas9-BD در باکتری Streptomyces، آن را به ابزاری مناسب برای ویرایش ژنوم این باکتری‌ها تبدیل کرده است.

کاربردهای Cas9-BD در مهندسی ژنتیک Streptomyces

Cas9-BD با سمیت کاهش یافته، برای ویرایش ژنوم Streptomyces به منظور افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه به روش‌های مختلفی مورد استفاده قرار گرفته است.

مهندسی پروموتر برای فعال‌سازی خوشه‌های ژنی بیوسنتز (BGCs) خاموش و افزایش تولید متابولیت

پروموترهای طبیعی در BGCها اغلب با پروموترهای قوی و همیشگی جایگزین می‌شوند تا تولید متابولیت‌های ثانویه افزایش یابد. با این حال، مهندسی همزمان چندین پروموتر در یک BGC با قدرت بیان بهینه، دشوار است. با استفاده از Cas9-BD، محققان با موفقیت یک کتابخانه پلاسمیدی ترکیبی با sgRNAهای متعدد ساختند که می‌توانست پروموترها را در یک BGC هدف قرار داده و جایگزین کند.

این روش برای فعال‌سازی BGC خاموش تولید کننده اویدومایسین در S. antibioticus و افزایش تولید راپامایسین در S. rapamicinicus در یک دور آزمایش مورد استفاده قرار گرفت. با توجه به اینکه دستکاری یک پروموتر در Streptomyces معمولاً 7 تا 10 روز طول می‌کشد و زمان اضافی برای حذف پلاسمید، جمع‌آوری اسپور و اعتبارسنجی از طریق آنالیز توالی در هر دور آزمایش ویرایش ژنوم مورد نیاز است، انتظار می‌رود که این روش زمان آزمایش را به طور قابل توجهی کاهش دهد.

ویرایش یا حذف چندگانه با استفاده از Cas9-BD می‌تواند به طور موثرتری کارایی فعال‌سازی بیان BGC خاموش را افزایش داده یا تولید متابولیت هدف را از طریق حذف BGCهای رقابتی بهبود بخشد. این دانش همچنین می‌تواند برای شناسایی و حذف مناطق غیرضروری در داخل ژنوم یا حتی برای توسعه یک ژنوم حداقلی برای Streptomyces به کار گرفته شود.

CRISPRi چندگانه با dCas9-BD

اگرچه dCas9 ابزاری بسیار ارزشمند برای کنترل بیان ژن‌ها یا مکان‌یابی پروتئین‌ها در مکان‌های دلخواه در ژنوم است، اما نشان داده شده است که به دلیل احتمال بالای اتصال خارج از هدف، برای Streptomyces سمی است. برای جلوگیری از این امر، یک فرآیند اضافی برای کاهش اتصال خارج از هدف مورد نیاز است، مانند کاهش بیان dCas9 یا بیان sgRNAهای مختلف، برای یافتن یک رویکرد مناسب، همانطور که در تحقیقات قبلی نشان داده شده است.

در این مطالعه، سویه‌های بیان کننده dCas9-BD حتی با چندین sgRNA، مهار رشد قابل توجهی را نشان ندادند. بنابراین، dCas9-BD امکان CRISPRi چندگانه را در سویه Streptomyces فراهم کرد. این امر به محققان اجازه داد تا یک کتابخانه sgRNA ترکیبی بسازند، که همراه با dCas9-BD به سویه S. coelicolor A3(2) منتقل شد تا بیان ژن‌های دخیل در مسیرهای متابولیکی رقابتی با مولکول‌های هدف را کاهش دهد. این امر غربالگری ژن‌های هدف را در مهندسی متابولیک میزبان با کنترل تصادفی بیان ژن‌های مختلف از طریق CRISPRi یا CRISPRa در مکان‌های مختلف DNA ژنومی با استفاده از sgRNAهای متعدد تسهیل کرد.

نتیجه‌گیری و چشم‌انداز

در این مطالعه، یک اصلاح Cas9 برای کاهش کارایی برش خارج از هدف توسعه داده شد. از طریق واکنش‌های in vitro تأیید شد که Cas9-BD اصلاح‌شده، کارایی برش خارج از هدف کمتری نسبت به Cas9 وحشی بدون از دست دادن کارایی برش در هدف نشان می‌دهد. پروتئین‌های اصلاح‌شده سمیت کمی برای Streptomyces هنگام بیان در سطوح بالا نشان دادند. با این حال، توالی‌یابی ژنوم نشان داد که ویرایش خارج از هدف هنوز با Cas9-BD رخ می‌دهد، که نشان می‌دهد نیاز به کار با چندین اکس‌کانژوگان پس از آزمایش ویرایش وجود دارد.

با استفاده از Cas9-BD و dCas9-BD مشابه، تولید متابولیت‌های ثانویه در Streptomyces به طور چشمگیری در یک آزمایش واحد با استفاده از کتابخانه‌ای حاوی sgRNAهای متعدد بهبود یافت. علاوه بر مهندسی DNA ژنومی، Cas9-BD برای захват BGC بزرگ FK506 مورد استفاده قرار گرفت که منجر به تولید موفق FK506 در یک سویه هترولوگ، S. coelicolor M1146، از طریق بازسازی پروموتر شد.

روش اصلاح Cas9 توسعه یافته در این مطالعه، به طور موثر برای Cas9 مشتق شده از S. pyogenes، به ویژه در میکروارگانیسم‌های با محتوای GC بالا، تأیید شد. این شامل نه تنها Streptomyces بلکه طیف وسیعی از سایر موجودات با محتوای GC بالا نیز می‌شود. این اصلاح همچنین می‌تواند برای مهندسی ژنتیک سلول‌های مختلف با ابزارهای مبتنی بر Cas9، مانند BEST یا پرایم ادیتینگ، و انواع Cas9، مانند موارد مشتق شده از Staphylococcus aureus، Neisseria meningitidis یا Streptococcus thermophilus، که ساختار کریستالی مشابهی با SpCas9 دارند، به کار گرفته شود.

علاوه بر این، بازسازی پروموتر چندگانه برای بهینه‌سازی بیان BGC و  in vivo BGC های بزرگ در Streptomyces با استفاده از Cas9 اصلاح‌شده نشان داده شد. این ابزار انتظار می‌رود زمان و نیروی کار مورد نیاز برای مطالعه متابولیت‌های ثانویه کدگذاری شده توسط BGCها در Streptomyces را کاهش دهد و به عنوان یک ابزار قدرتمند در تحقیقات بیوتکنولوژی و دارویی مبتنی بر Streptomyces عمل کند.

منبع: Engineered CRISPR-Cas9 for Streptomyces sp. genome editing to improve specialized metabolite production