مقدمه:
تا حالا شده در آزمایشگاه، آنقدر درگیر پروتکلها، پیپتها، و محلولهای عجیب و غریب باشید که در نهایت، نتیجهای بگیرید که نه تنها با فرضیهتان جور درنمیآید، بلکه از قوانین فیزیک و منطق هم خارج است؟ بله، از آن لحظات جادویی صحبت میکنم که یک کلونی با افتخار رشد کرده، اما PCR شما (همان Polymerase Chain Reaction معروف) فقط یک باند “فیک” (Fake Band) تحویلتان میدهد.
تشریح فاجعه آزمایشگاهی در چند پرده
پرده اول: امید واهی کلونینگ
محقق (در ذهن): «آفرین! کلونینگ با موفقیت انجام شد! حالا وقت سِکانس (Sequencing) است تا ژن را با چشم خودم ببینم و مقاله را سابمیت کنم. قطعاً من یک نوبل کوچک خواهم گرفت!»
اینجا همان لحظهای است که محقق، با هیجان، نمونهای را که با هزار پیپتینگ دقیق و دمای کنترلشده آماده کرده، برای شرکت سِکانس کننده میفرستد.
پرده دوم: پاسخ سرد و بیتفاوت شرکت سِکانس کننده
شرکت سِکانس کننده (با ایمیل اتوماتیک): «متأسفیم، نمونه شما برگشت خورده است. لطفاً مجدداً برای ما نمونه بفرستید.»
اینجا اوج درام است! گویی به شما گفتهاند که کل زحمتتان کشک بوده است! حالا محقق، خشمگین از سیستم، از آزمایشگاه، و از همه موجودات دنیا، برمیگردد سر میز کارش تا ببیند کجای کار ایراد داشته.
پرده سوم: رویارویی با PCR و “باند فیک”
محقق، برای اینکه مطمئن شود نمونهاش سالم است، تصمیم میگیرد یک PCR سریع انجام دهد. وقتی ژل را داخل چمبر الکتروفورز میگذارد و منتظر باند میماند، ناگهان میبیند: یک باند! یک کلونی PCR با باند فیک! یعنی یک باند DNA هست، اما آن چیزی نیست که باید باشد! یک باند اضافی یا یک باند در جای نادرست.
پرده چهارم: تحلیل «باند فیک»
باند فیک دقیقاً چیست؟ این باند میتواند ناشی از پرایمرهای (Primers) نامناسب، اتصال غیر اختصاصی (Non-specific binding)، آلودگی (Contamination) یا حتی باقیماندههای DNA پلاسید (Plasmid) باشد. در واقع، این یک فریاد است از طرف DNA که میگوید: «من کاری را که تو فکر میکردی نکردم!»
۶. پرده ی پنجم: راهکار حرفهای، نه «ایشالا»ای!
برای خداحافظی با «باند فیک» و تکیه بر علم، نه «ایشالا»، چند راهکار وجود دارد:
- بهینهسازی دمای اتصال (Annealing Temperature): شاید دمای پایینتر یا بالاتر، پرایمرها را وادار به اتصال دقیقتر کند.
- استفاده از پرایمرهای اختصاصیتر: طراحی مجدد پرایمرها و بررسی توالیهای هدف.
- پاکسازی دقیقتر نمونه: از کیتهای (Kits) پاکسازی DNA با کیفیت استفاده کنید تا ناخالصیها حذف شوند.
نتیجهگیری: لبخندی به روی ناکامیها
ما در آزمایشگاه میدانیم که علم یک جاده پرپیچ و خم است. با اینکه از دست «باند فیک» و «ایشالای» PCR عصبانی میشویم، اما همین ناکامیها هستند که ما را به سمت تحقیق و بهینهسازی بیشتر سوق میدهند. دفعه بعد که دیدید باند فیک در الکتروفورز نشسته ، فقط یک فنجان قهوه بنوشید، پرایمرهایتان را چک کنید، و دوباره شروع کنید!