راهنمای جامع ویرایش ژنوم: از CRISPR تا TALEN

آیا تا به حال به این فکر کرده‌اید که چگونه می‌توانیم کد ژنتیکی موجودات زنده را به دلخواه خود تغییر دهیم؟ ویرایش ژنوم، حوزه‌ای جذاب و انقلابی در علم بیولوژی است که به ما این امکان را می‌دهد. در این مقاله، به بررسی یکی از قدرتمندترین ابزارهای این حوزه، یعنی سیستم CRISPR/Cas9 می‌پردازیم و به تمامی سوالات کلیدی شما پاسخ می‌دهیم.

CRISPR/Cas9: انقلابی در مهندسی ژنتیک

سیستم CRISPR/Cas9 در حقیقت یک مکانیسم دفاعی طبیعی در باکتری‌هاست که دانشمندان آن را برای ویرایش ژنوم مهندسی کرده‌اند. این سیستم از دو بخش اصلی تشکیل شده: یک راهنمای RNA (sgRNA) که به دنبال توالی DNA هدف می‌گردد، و یک آنزیم Cas9 که DNA را برش می‌دهد.

۱. دقت و اختصاصیت: آیا یک اولیگو برای یک ژن کافی است؟

شاید برای شما هم این سوال پیش آمده باشد که آیا برای جلوگیری از برش‌های ناخواسته (off-target)، باید بیش از یک اولیگو طراحی کنیم؟ در اکثر موارد، طراحی دقیق یک راهنمای RNA با طول ۲۰ نوکلئوتید برای هدف‌گیری اختصاصی کافی است. با این حال، به دلیل اینکه توالی‌های بسیار مشابهی در ژنوم وجود دارند، احتمال برش ناخواسته وجود دارد. برای به حداقل رساندن این مشکل، باید از ابزارهای بیوانفورماتیک برای انتخاب دقیق‌ترین توالی ممکن استفاده کرد. در برخی موارد، استفاده از Cas9 nickase که فقط یکی از رشته‌های DNA را برش می‌دهد، می‌تواند دقت را به شدت افزایش دهد.

۲. مقایسه CRISPR/Cas9 با TALENs

سیستم TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) نیز مانند CRISPR/Cas9 برای ویرایش ژنوم استفاده می‌شود. اما تفاوت اصلی آنها در انعطاف‌پذیری و سادگی است. در CRISPR، شما فقط نیاز به طراحی یک راهنمای RNA دارید که بسیار ساده و سریع است. در مقابل، TALENs برای هر توالی هدف نیاز به طراحی یک پروتئین پیچیده دارند که زمان‌برتر و پرهزینه‌تر است. به همین دلیل، CRISPR/Cas9 به سرعت جایگزین TALENs در بسیاری از آزمایشگاه‌ها شده است.

بهینه‌سازی و کارایی: چگونه به بهترین نتیجه برسیم؟

برای دستیابی به حداکثر کارایی در ویرایش ژنوم، توجه به جزئیات فنی ضروری است.

۱. انتخاب اهداکننده DNA: اولیگوهای ss، اولیگوهای ds یا بازوهای همولوگ؟

برای ترمیم DNA پس از برش توسط Cas9، نیاز به یک الگو (donor DNA) داریم. این الگو می‌تواند به صورت اولیگوهای تک‌رشته (ss oligos)، اولیگوهای دو‌رشته (ds oligos) یا بازوهای همولوگ بزرگ از یک پلاسمید باشد.

• اولیگوهای تک‌رشته به دلیل کارایی بالا و سادگی ساخت، برای وارد کردن جهش‌های نقطه‌ای یا جایگزینی توالی‌های کوچک بسیار مناسب هستند. طول توصیه شده برای آن‌ها حداکثر ۲۰۰ نوکلئوتید است.
• بازوهای همولوگ بزرگ (بیش از ۱kb) از پلاسمیدها برای وارد کردن توالی‌های بزرگ مانند ژن‌های GFP یا IRES-Cre استفاده می‌شوند.

۲. نقش PAM در هدف‌گیری

سیستم CRISPR/Cas9 برای شروع برش، نیاز به یک توالی کوتاه به نام PAM (Protospacer Adjacent Motif) در نزدیکی توالی هدف دارد. رایج‌ترین PAM برای Cas9 از باکتری S. pyogenes، توالی NGG است. این توالی باید در ژنوم وجود داشته باشد تا برش انجام شود. این موضوع تا حدی انعطاف‌پذیری هدف‌گیری را محدود می‌کند، اما به دلیل شیوع بالای توالی NGG در ژنوم انسان و سایر موجودات، هنوز هم اکثر ژن‌ها قابل ویرایش هستند.

پاسخ به سوالات فنی شما

Q- آیا رویدادهای indels (وارد کردن و حذف تصادفی نوکلئوتیدها) که در یک لوکوس خاص اتفاق می‌افتند، بین سلول‌ها یکسان هستند؟ آیا نباید قبل از توسعه و غنی‌سازی، یک مرحله کلونال را طی کنیم؟ A- رویدادهای indel به دلیل ماهیت تصادفی مکانیسم ترمیم DNA (NHEJ)، بین سلول‌ها یکسان نیستند. برای اطمینان از همگن بودن جمعیت سلولی ویرایش‌شده، حتماً باید یک مرحله کلونینگ انجام شود.

Q- برای مراقبت از مشکل off-target، آیا باید بیش از یک اولیگو برای یک ژن طراحی کنیم؟ A- معمولاً یک راهنمای RNA با طراحی دقیق کافی است. اما برای اطمینان بیشتر، می‌توانید چندین راهنما طراحی کرده و بهترین آن را انتخاب کنید.

Q- مقالات متعددی در مورد فعالیت غیر‌اختصاصی Cas9 صحبت کرده‌اند. آیا می‌توانید در مورد آن نظر بدهید؟ A- فعالیت غیر‌اختصاصی (non-specific) به این معنی است که Cas9 می‌تواند در محل‌های خارج از هدف اصلی (off-target sites) نیز برش ایجاد کند. این مسئله به دلیل وجود توالی‌های بسیار مشابه با توالی هدف در ژنوم رخ می‌دهد و با طراحی دقیق راهنمای RNA و استفاده از Cas9 nickase می‌توان آن را به حداقل رساند.

Q- آیا Cas9 در صورت وجود توالی‌های DNA بسیار مشابه در ژنوم با تنها چند تفاوت نوکلئوتیدی، باعث دو برش می‌شود؟ A- بله، Cas9 می‌تواند توالی‌های بسیار مشابه را نیز تشخیص داده و برش دهد. این همان دلیلی است که مشکل off-target ایجاد می‌شود.

Q- آیا یک هدف ۲۰ نوکلئوتیدی برای هدف‌گیری اختصاصی کافی است؟ آیا off-site targeting خواهید داشت؟ A- یک توالی ۲۰ نوکلئوتیدی معمولاً برای اختصاصیت کافی است، اما احتمال off-site targeting به دلیل شباهت توالی‌ها در ژنوم وجود دارد.

Q- چگونه سیستم CRISPR/Cas9 را با TALENs از نظر اختصاصیت هدف مقایسه می‌کنید؟ A- هر دو سیستم می‌توانند به دقت بالایی در هدف‌گیری برسند. اما انعطاف‌پذیری و سادگی طراحی در CRISPR/Cas9 آن را به ابزاری ترجیحی تبدیل کرده است.

Q- چگونه می‌توان جهش‌زایی را در Danio (ماهی زبرا) توسط یک راهنمای RNA خاص پیش‌بینی کرد؟ در پایین‌دست یا بالادست سه نوکلئوتید 3′ انتهایی؟ A- برش Cas9 معمولاً در سه یا چهار نوکلئوتید بالادست (upstream) از توالی PAM اتفاق می‌افتد. برای پیش‌بینی جهش‌زایی در Danio، باید از ابزارهای بیوانفورماتیک برای شناسایی سایت‌های برش و توالی‌های مشابه استفاده کرد.

– وقتی در مورد جهش نقطه‌ای صحبت می‌کنید، آیا منظور شما جایگزینی یک اسید آمینه نقطه‌ای است؟ A- بله، “جهش نقطه‌ای” (point mutation) معمولاً به جایگزینی یک نوکلئوتید اشاره دارد که می‌تواند منجر به جایگزینی یک اسید آمینه (point amino acid substitution) یا جهش‌های خاموش شود.

Q- آیا وارد کردن توالی‌های بزرگی مانند GFP یا IRES-Cres مجاز است؟ A- بله، با استفاده از روش ترمیم HR (Homology-Directed Repair) و پلاسمیدهایی با بازوهای همولوگ بزرگ، می‌توانید توالی‌های بزرگ را وارد کنید.

Q- آیا هیچ موتانت Cas9 وجود دارد که نیاز به PAM نداشته باشد؟ A- خیر، همه انواع شناخته‌شده Cas9 برای شروع برش نیاز به یک توالی PAM دارند. اما موتانت‌هایی با PAMهای متفاوت (غیر از NGG) مانند NGA، NGC و … وجود دارند که انعطاف‌پذیری بیشتری فراهم می‌کنند.

Q- چگونه تغییرات را در ژنوم ایجاد می‌کنیم؟ آیا جهش‌ها را در اولیگوهای طراحی‌شده قرار می‌دهیم؟ A- بله، برای ایجاد جهش‌های نقطه‌ای یا وارد کردن توالی‌های کوچک، باید جهش مورد نظر را در اولیگوهای اهداکننده (donor oligos) قرار دهید.

Q- آیا اولیگوها باید 5′ فسفریله باشند؟ A- بله، برای کارایی بالاتر در برخی مکانیسم‌های ترمیم DNA، بهتر است اولیگوها 5′ فسفریله باشند.

Q- مزیت ناک‌اوت با TAL یا CRISPR در مقایسه با shRNA پایدار مبتنی بر وکتور چیست؟ A- ناک‌اوت ژنی با CRISPR/Cas9 و TALENs دائمی و در سطح DNA است، در حالی که knockdown با shRNA موقتی و در سطح RNA است.

Q- چرا چنین تفاوت بزرگی در برش (درصد indel) و راندمان ترانسفکشن وجود دارد؟ A- کارایی ترانسفکشن به معنی ورود موفق وکتور به سلول است، اما کارایی برش (indel) به فعال بودن سیستم Cas9/راهنما در داخل سلول و ایجاد برش موفق بستگی دارد. این دو فاکتور مستقل از یکدیگر هستند.

Q- اگر یک پروتئین هدف بسیار بزرگ و چندکاره باشد، طراحی sgRNA در کدام سایت بهتر است؟ چگونه بررسی کنیم که جهش، سنتز پروتئین را مسدود می‌کند؟ چگونه بررسی کنیم که اثر به دلیل جهش هدف است؟ A- برای پروتئین‌های بزرگ، بهتر است sgRNA را در یک دومین عملکردی کلیدی یا در نزدیکی ابتدای ژن (نزدیک به ATG) طراحی کنید. برای بررسی مسدود شدن سنتز پروتئین، می‌توانید از وسترن بلات (Western Blot) استفاده کنید. برای تأیید اینکه اثر به دلیل جهش هدف است، باید توالی ژنوم را در محل برش بررسی کنید و از کنترل‌های مناسب استفاده کنید.

Q- چگونه یک راهنمای RNA برای وارد کردن یک کاسِت انتخابی (مانند نئومایسین) طراحی کنیم؟ A- راهنمای RNA فقط محل برش را تعیین می‌کند. برای وارد کردن کاسِت، باید یک پلاسمید اهداکننده حاوی کاسِت نئومایسین و بازوهای همولوگ به محل برش طراحی کنید.

Q- انعطاف‌پذیری crRNA هدف‌گیر ۲۰ نوکلئوتیدی را می‌فهمم، اما اگر توالی PAM باید در هدف ژنومی وجود داشته باشد، آیا این انعطاف‌پذیری هدف‌گیری را از بین نمی‌برد؟ A- PAM انعطاف‌پذیری را تا حدی محدود می‌کند، اما به دلیل شیوع بالای توالی NGG و وجود Cas9های مختلف با PAMهای متفاوت، انعطاف‌پذیری همچنان بسیار بالاست.

Q- می‌توانید در مورد PAM NGG کمی بیشتر توضیح دهید؟ اگر چنین توالی‌ای در لوکوس مورد نظر وجود نداشته باشد، چه می‌شود؟  PAM NGG یک توالی سه‌نوکلئوتیدی است که برای فعال شدن Cas9 ضروری است. اگر چنین توالی‌ای در نزدیکی محل هدف شما وجود نداشته باشد، نمی‌توانید از Cas9 از گونه S. pyogenes استفاده کنید. در این صورت، باید از Cas9های دیگر با PAMهای متفاوت (مانند Cas12a با PAM TTTN) استفاده کنید.

Q- لوکوس‌های PAM در ژنوم انسان چقدر رایج هستند و آیا این امر ژن‌هایی را که می‌توان ویرایش کرد محدود می‌کند؟ A- PAM NGG در ژنوم انسان بسیار رایج است و تقریباً هر ۱۳ نوکلئوتید یک بار تکرار می‌شود. این شیوع بالا به این معنی است که اکثر ژن‌ها قابل ویرایش هستند و محدودیت بزرگی ایجاد نمی‌کند.

Q- آیا پروموتر U6 در رویان ماهی زبرا بیان را هدایت می‌کند؟ A- بله، پروموتر U6 که یک پروموتر RNA پلیمراز III است، به طور گسترده برای بیان راهنمای RNA در رویان ماهی زبرا استفاده می‌شود.

Q- آیا امکان دارد یک مارکر انتخابی مانند نئومایسین یا یک مارکر فلورسنت را در یک پلاسمید Cas9/CRISPR موجود وارد کنیم؟ A- بله، می‌توانید یک مارکر انتخابی را با استفاده از روش‌های کلونینگ مولکولی به پلاسمید Cas9/CRISPR موجود اضافه کنید.

آماده‌اید که ژنوم را به دلخواه خود ویرایش کنید؟

ما  آماده‌ایم تا با ارائه محصولات و خدمات ویرایش ژنوم با بالاترین کیفیت، به شما کمک کنیم. هر آنچه برای موفقیت در پروژه‌هایتان نیاز دارید، در اختیار شما قرار می‌دهیم.

با ما تماس بگیرید 

#ویرایش_ژنوم

#CRISPR

#TALEN

#ژن_درمانی

#بیولوژی_مولکولی

#مهندسی_ژنتیک

#ژنتیک

#زیست_فناوری

#پژوهش_ژنتیک