واقعیت یا افسانه؟ چند باور رایج در استخراج RNA با ترایزول که شاید نتایج شما را به تحت تاثیر قرار داده باشند.
۱. حل کردن سلولها در ترایزول
احتیاط: هنگام حل کردن سلولها در ترایزول، پیپتاژ شدید و ایجاد حباب یا استفاده از سرنگ میتواند باعث تجمع تودهای (clumps) شود.
حکم: این یک احتیاط تا حد زیادی معتبر است، اما با جزئیات بیشتر.
- پیپتاژ شدید و ایجاد حباب میتواند مشکلساز باشد زیرا میتواند باعث دناتوره شدن پروتئینها و به طور بالقوه برش RNA شود. در حالی که ترایزول یک عامل قوی برای دناتوره کردن پروتئینها است، نیروی مکانیکی بیش از حد ناشی از پیپتاژ شدید همچنان میتواند RNA را تخریب کند. بهتر است از مخلوط کردن و پیپتاژ آهسته و ملایم استفاده کنید تا از لیز شدن کامل سلولها اطمینان حاصل شود.
- استفاده از سرنگ برای برش DNA، اگرچه گاهی در پروتکلهای قدیمی برای حذف DNA توصیه میشد، اما با روشهای مدرن مبتنی بر ترایزول ضروری نیست. خود ترایزول، در ترکیب با مراحل بعدی کلروفرم و ایزوپروپانول، در جداسازی RNA از DNA و پروتئینها بسیار مؤثر است. استفاده از سرنگ یک مرحله غیرضروری و خطر تخریب RNA را به همراه دارد.
۲. ورتکس کردن بعد از افزودن کلروفرم
احتیاط: بعد از افزودن کلروفرم، ورتکس نکنید زیرا این کار میتواند منجر به آلودگی DNA ژنومی شود.
حکم: این بیشتر یک افسانه است و در واقع میتواند مانع از جداسازی فاز مناسب شود.
- کلید جداسازی مؤثر فاز، ایجاد یک مخلوط همگن از ترایزول، نمونه و کلروفرم است. ورتکس کردن به مدت حدود ۱۵ ثانیه روش توصیه شده برای دستیابی به این هدف است، زیرا از اختلاط کامل و تقسیمبندی مؤثر فازها اطمینان حاصل میکند.
- این ایده که ورتکس کردن باعث آلودگی DNA ژنومی میشود، یک تصور غلط رایج است. آلودگی DNA ژنومی در درجه اول نتیجه جداسازی ناقص فاز است. اگر به طور کامل مخلوط نکنید، مقداری DNA ممکن است در فاز آبی با RNA باقی بماند. روش ترایزول به گونهای طراحی شده است که DNA در رابط (interface) و پروتئینها در فاز آلی قرار گیرند. تا زمانی که فاز آبی را با دقت پیپتاژ کنید و رابط را به هم نزنید، میتوانید از آلودگی DNA جلوگیری کنید. یک تکان ملایم به اندازه ورتکس مناسب برای اطمینان از این جداسازی مؤثر نخواهد بود.
۳. پیپتاژ کردن پلت RNA
احتیاط: هنگام حل کردن مجدد پلت RNA در آب یا بافر، پیپتاژ نکنید زیرا این کار میتواند RNA را برش دهد.
حکم: این یک احتیاط کاملاً معتبر است.
- RNA یک مولکول شکننده است و پیپتاژ شدید میتواند آن را برش دهد، به خصوص اگر پلت به طور کامل حل نشده باشد. پلت RNA محصول نهایی و خالصشده است و رسیدگی به آن با احتیاط برای حفظ یکپارچگی آن ضروری است.
- بهترین روش این است که آب یا بافر عاری از RNase (مانند آب تیمار شده با DEPC) را اضافه کنید، به آرامی لوله را تکان دهید و سپس چند دقیقه صبر کنید تا پلت دوباره هیدراته شده و حل شود. همچنین میتوانید به آرامی به لوله ضربه بزنید تا کمک کنید، اما از پیپتاژ یا ورتکس کردن شدید خودداری کنید. اطمینان از حل شدن کامل پلت قبل از استفاده از RNA نیز برای کاربردهای پاییندستی دقیق بسیار مهم است.
شما چه سؤال یا چالشی در زمینه استخراج RNA دارید؟ آن را در بخش نظرات با ما در میان بگذارید.
#ترایزول
#استخراج_RNA
#بیولوژی_مولکولی
#آزمایشگاه
#پروتکل_آزمایشگاهی
#RNA
#عیب_یابی_آزمایشگاهی