آشنایی با روشهای کشت باکتری: از کشت عمودی تا چمنی و خطی
در دنیای میکروبیولوژی، کشت و پرورش باکتریها یک مرحله اساسی و حیاتی است. از تشخیص بیماریها گرفته تا تحقیقات دارویی و بیوتکنولوژی، همه و همه به روشهای دقیق و کارآمد برای رشد و جداسازی باکتریها وابسته هستند. اما آیا میدانستید که روشهای مختلفی برای کشت باکتری وجود دارد که هر کدام کاربردها و اهداف خاص خود را دارند؟
در این مقاله وبلاگی، قصد داریم به سه روش رایج کشت باکتری بپردازیم: کشت عمودی (Stab Culture)، کشت چمنی (Lawn Culture) و کشت خطی (Streak Culture). با شناخت تفاوتها و کاربردهای هر یک، میتوانید بهترین روش را برای اهداف آزمایشگاهی خود انتخاب کنید و نتایج دقیقتری به دست آورید.
۱. کشت عمودی (Stab Culture): برای نگهداری و بررسی حرکت
کشت عمودی، که به آن “استاب کالچر” نیز گفته میشود، یک روش ساده اما بسیار کارآمد برای نگهداری بلندمدت سویههای باکتریایی و همچنین بررسی حرکت (motility) باکتریها است.
نحوه انجام
در این روش، از یک محیط کشت نیمهجامد (مانند آگار با غلظت ۰.۵% تا ۰.۷%) در داخل یک لوله آزمایش استفاده میشود. ابتدا، لوپ کشت را با احتیاط استریل کرده و مقدار کمی از کلونی باکتری مورد نظر را برمیداریم. سپس، لوپ را به صورت عمودی (stab) و دقیقاً در مرکز محیط کشت، تا عمق تقریباً یک سانتیمتری فرو میبریم و سپس به آرامی خارج میکنیم. درب لوله را محکم میبندیم و در دمای مناسب برای رشد باکتری انکوبه میکنیم.
کاربردها و مزایا
نگهداری سویهها: به دلیل کاهش سطح تماس با هوا، اکسیژن کمتری به باکتری میرسد که باعث کند شدن متابولیسم و افزایش طول عمر باکتری در محیط کشت میشود. این امر برای نگهداری سویههای استاندارد یا سویههایی که به ندرت استفاده میشوند، بسیار مناسب است.
بررسی حرکت باکتری (Motility Test): باکتریهای متحرک، پس از رشد، در اطراف خط فرو رفته لوپ پخش میشوند و محیط را کدر میکنند. باکتریهای غیرمتحرک فقط در مسیر فرو رفتن لوپ رشد میکنند.
بررسی نیاز به اکسیژن: این روش میتواند اطلاعاتی در مورد نیاز باکتری به اکسیژن ارائه دهد؛ باکتریهای هوازی در بالای خط کشت (جایی که اکسیژن بیشتر است) رشد میکنند، بیهوازیها در عمق، و بیهوازیهای اختیاری در سراسر محیط رشد میکنند.
۲. کشت چمنی (Lawn Culture): برای تست حساسیت آنتیبیوتیکی و تولید واکسن
کشت چمنی، که نام آن از شباهت رشد باکتری به یک چمن سبز گرفته شده است، روشی برای ایجاد یک لایه یکنواخت و متراکم از باکتریها روی سطح یک محیط کشت جامد (معمولاً آگار در پلیت پتری) است.
نحوه انجام:
ابتدا، محیط کشت جامد را در پلیت پتری آماده میکنیم. سپس، یک لوپ استریل را با مقدار زیادی از کلونی باکتری یا سوسپانسیون باکتریایی (به عنوان مثال، از یک سوسپانسیون با کدورت استاندارد ۰.۵ مکفارلند) آغشته میکنیم. لوپ را به آرامی و به صورت یکنواخت در تمام جهات روی سطح آگار میکشیم تا کل سطح پلیت با باکتری پوشانده شود. این کار را میتوان با سواب پنبهای استریل نیز انجام داد. پس از خشک شدن سطح، پلیت را در دمای مناسب انکوبه میکنیم.
کاربردها و مزایا:
تست حساسیت آنتیبیوتیکی (Antibiotic Susceptibility Testing – AST): رایجترین کاربرد کشت چمنی، انجام تست دیسک دیفیوژن (Disk Diffusion Test) یا کربی-بائر (Kirby-Bauer) است. پس از کشت چمنی باکتری، دیسکهای آنتیبیوتیک روی سطح آگار قرار داده میشوند. مناطق عدم رشد (zone of inhibition) اطراف دیسکها نشاندهنده حساسیت باکتری به آنتیبیوتیک است.
تولید واکسن: برای تولید واکسنهای باکتریایی که نیاز به مقادیر زیادی از سلولهای باکتریایی دارند، از کشت چمنی برای رشد انبوه باکتریها استفاده میشود.
باکتریوفاژ درمانی: برای مطالعه و جداسازی باکتریوفاژها (ویروسهای آلودهکننده باکتری)، نیاز به یک لایه یکنواخت از باکتری میزبان است تا بتوان نواحی شفاف (plaques) ناشی از لیز شدن باکتریها توسط فاژ را مشاهده کرد.
۳. کشت خطی (Streak Culture): برای جداسازی و خالصسازی کلونیها
کشت خطی، که به آن “استریک کالچر” نیز گفته میشود، یک تکنیک پایهای و پرکاربرد در میکروبیولوژی است که برای جداسازی سویههای باکتریایی از یک نمونه مخلوط و به دست آوردن کلونیهای خالص (pure colonies) استفاده میشود.
نحوه انجام:
این روش شامل پخش کردن تدریجی باکتریها روی سطح یک محیط کشت جامد (اغلب آگار در پلیت پتری) با استفاده از یک لوپ استریل است. مراحل معمولاً به این صورت هستند:
لوپ را استریل کرده و اجازه میدهیم خنک شود.
مقدار کمی از نمونه حاوی باکتری (مخلوط یا کشت اولیه) را برمیداریم.
یک سری خطوط موازی و نزدیک به هم را در یک چهارم (یا یک سوم) اول پلیت میکشیم.
لوپ را دوباره استریل کرده و آن را از ناحیه اول (اما نه از ابتدای خطوط) به داخل ناحیه دوم میکشیم تا تعدادی از باکتریها به آن ناحیه منتقل شوند. سپس خطوط جدیدی در ناحیه دوم میکشیم.
این فرآیند استریل کردن لوپ و کشیدن خطوط را برای نواحی سوم و چهارم تکرار میکنیم. در هر مرحله، تعداد باکتریهای منتقل شده به لوپ کاهش مییابد.
پلیت را در دمای مناسب انکوبه میکنیم.
کاربردها و مزایا:
خالصسازی (Purification): هدف اصلی این روش، رقیق کردن تدریجی باکتریها روی سطح آگار است تا در نهایت، سلولهای باکتریایی منفرد از یکدیگر جدا شوند. هر سلول منفرد سپس تقسیم شده و یک کلونی خالص را تشکیل میدهد که از نظر ژنتیکی یکسان هستند.
جداسازی سویهها: هنگامی که یک نمونه حاوی چندین نوع باکتری است (مانند نمونههای بالینی)، کشت خطی به ما امکان میدهد هر نوع باکتری را به صورت کلونیهای مجزا و خالص جدا کنیم.
آمادهسازی برای مطالعات بیشتر: کلونیهای خالص به دست آمده از کشت خطی میتوانند برای مطالعات بیوشیمیایی، ژنتیکی، تشخیص هویت باکتری و سایر آزمایشها استفاده شوند.
انتخاب روش مناسب: کلید موفقیت در آزمایشگاه
انتخاب روش کشت مناسب بستگی به هدف آزمایش شما دارد:
اگر به دنبال نگهداری طولانیمدت سویهها یا بررسی حرکت هستید، کشت عمودی (Stab Culture) گزینه مناسبی است.
برای انجام تستهای حساسیت آنتیبیوتیکی، تولید انبوه باکتری یا مطالعات باکتریوفاژ، کشت چمنی (Lawn Culture) ایدهآل است.
و در نهایت، اگر میخواهید کلونیهای خالص از یک نمونه مخلوط به دست آورید یا سویههای باکتریایی را از یکدیگر جدا کنید، کشت خطی (Streak Culture) بهترین و مؤثرترین روش خواهد بود.
با درک صحیح اصول و کاربردهای هر یک از این روشها، میتوانید به طور مؤثرتری در آزمایشگاههای میکروبیولوژی فعالیت کنید و به نتایج دقیقتر و قابل اعتمادتری دست یابید. هر کدام از این تکنیکها، آجرهای بنیادی در ساختار دانش ما از دنیای نامرئی میکروبها هستند.