گزارشی از SmLiveFISH: روشی نوین برای ردیابی بلادرنگ mRNA در سلول‌های زنده

معرفی SmLiveFISH: ابزاری قدرتمند برای مطالعه پویایی mRNA

ردیابی مولکول‌های mRNA بومی و دست‌نخورده با وضوح تک‌مولکولی

گزارش‌ها حاکی از توسعه یک روش جدید به نام SmLiveFISH است که امکان ردیابی بلادرنگ مولکول‌های mRNA بومی و دست‌نخورده را با وضوح تک‌مولکولی در سلول‌های زنده فراهم می‌کند. این فناوری امکان مشاهده پویایی‌های فضایی و زمانی mRNA را در داخل سلول در لحظه فراهم می‌آورد، که پیشرفت قابل توجهی در مطالعه تنظیم ژن و فرآیندهای سلولی محسوب می‌شود.

اجزای اصلی پلتفرم SmLiveFISH: پلاسمیدهای Csm و crRNA

پلتفرم SmLiveFISH از دو جزء اصلی تشکیل شده است: یک پلاسمید کدکننده پروتئین Csm و یک پلاسمید کدکننده crRNA برنامه‌پذیر. پروتئین‌های Csm بخشی از سیستم ایمنی CRISPR-Cas نوع III هستند که در این روش برای شناسایی و برچسب‌زنی mRNA هدف به کار می‌روند. crRNA برنامه‌پذیر حاوی توالی‌های مکمل mRNA هدف است که پروتئین Csm را به آن هدایت می‌کند.

روش کلی برای ساخت آرایه‌های CRISPR طولانی

برای جزء crRNA، یک روش کلی برای ساخت آرایه‌های CRISPR طولانی تا 24 توالی مکمل RNA هدف ارائه شده است. این قابلیت امکان هدف قرار دادن چندین ناحیه از یک مولکول mRNA را به طور همزمان فراهم می‌کند، که می‌تواند سیگنال ردیابی را تقویت کرده و حساسیت روش را افزایش دهد.

شناسایی دو مکانیسم مجزا برای مکان‌یابی mRNAهای NOTCH2 و MAP1B

با استفاده از SmLiveFISH، دو مکانیسم مجزا برای مکان‌یابی mRNAهای *NOTCH2* و *MAP1B* شناسایی شده است. mRNA *NOTCH2* از طریق انتقال همزمان با ترجمه به نواحی پیرامونی هسته سلول منتقل می‌شود، در حالی که mRNA *MAP1B* از طریق انتقال جهت‌دار به نواحی محیطی سلول مکان‌یابی می‌شود. این یافته‌ها نشان می‌دهند که سلول‌ها از مکانیسم‌های مختلفی برای تنظیم توزیع mRNAهای مختلف در داخل خود استفاده می‌کنند.

مزایای SmLiveFISH نسبت به روش‌های تصویربرداری RNA در سلول‌های زنده

عدم نیاز به بیان خارجی یا برچسب‌زنی ژنتیکی RNA

SmLiveFISH یک پیشرفت قابل توجه نسبت به تکنیک‌های قبلی تصویربرداری RNA در سلول‌های زنده محسوب می‌شود. این روش نیاز به بیان خارجی یا برچسب‌زنی ژنتیکی RNA را برطرف می‌کند. روش‌های قبلی اغلب نیاز به معرفی نسخه‌های تغییر یافته از RNA هدف به سلول داشتند، که ممکن بود رفتار طبیعی RNA را تغییر دهد. SmLiveFISH با هدف قرار دادن mRNAهای بومی، این مشکل را حل کرده است.

امکان تصویربرداری از RNAهای کم‌مقدار و غیرتکراری

این پلتفرم می‌تواند برای تصویربرداری از RNAهای کم‌مقدار و غیرتکراری با حفظ وضوح تک‌مولکولی و پس‌زمینه کم استفاده شود. بسیاری از RNAهای مهم در سلول‌ها در مقادیر کم بیان می‌شوند و روش‌های قبلی در تصویربرداری از آن‌ها با مشکل مواجه بودند. SmLiveFISH با افزایش حساسیت و کاهش نویز، این امکان را فراهم کرده است.

حفظ وضوح تک‌مولکولی و پس‌زمینه کم

حفظ وضوح تک‌مولکولی به این معنی است که می‌توان مولکول‌های mRNA منفرد را در داخل سلول مشاهده و ردیابی کرد. پس‌زمینه کم نیز به این معنی است که سیگنال‌های غیرواقعی که می‌توانند تفسیر نتایج را دشوار کنند، به حداقل رسیده‌اند.

محدودیت‌های احتمالی SmLiveFISH

احتمال تغییر رفتار طبیعی RNA به دلیل اتصال کمپلکس‌های Csm

با این حال، مانند سایر روش‌های تصویربرداری RNA در سلول‌های زنده، SmLiveFISH نیز ممکن است تا حدی رفتار طبیعی RNA را تغییر دهد. اگرچه هیچ تغییری در پایداری mRNA (مقدار، سرعت تجزیه و محصولات تخریب) یا ترجمه مشاهده نشده است، این احتمال وجود دارد که اتصال چندین کمپلکس Csm به ناحیه 3′ UTR mRNA بر تاخوردگی mRNA، اتصال فاکتورهای تنظیمی *trans* (RBPs و microRNAs) یا سرعت انتقال و/یا انتشار تأثیر بگذارد. محققان در این زمینه باید احتیاط لازم را داشته باشند و نتایج را با در نظر گرفتن این احتمال تفسیر کنند.

مقایسه SmLiveFISH با سیستم‌های Cas13

کارایی محدود سیستم‌های Cas13 در تصویربرداری RNA

به موازات SmLiveFISH، دو سیستم Cas13 (PspCas13b و RfxCas13d) که کارایی تصویربرداری برای RNAهای بسیار فراوان و تکراری نشان داده‌اند، مورد آزمایش قرار گرفتند. هر دو پروتئین Cas13 در این آزمایش‌ها کارایی محدودی نشان دادند، حتی هنگام تلاش برای تصویربرداری از RNA غیرکدکننده طولانی و فراوان *XIST*.

کارایی بالاتر CRISPR–Csm برای تصویربرداری از تک‌رونوشت‌ها

کارایی نسبی بالاتر CRISPR–Csm برای تصویربرداری از تک‌رونوشت‌ها در این مطالعه ممکن است ناشی از میل ترکیبی حدود 30 برابر بیشتر Csm برای RNA در مقایسه با Cas13 و/یا ماهیت چندزیرواحدی آن باشد که امکان اتصال ≥3 مولکول Csm3–GFP در هر کمپلکس را فراهم می‌کند. این ویژگی‌ها می‌توانند به افزایش حساسیت و قدرت سیگنال در SmLiveFISH کمک کنند.

بهره‌گیری از قابلیت Cas6 در پردازش pre-crRNAهای طولانی

افزایش نسبت سیگنال به نویز با استفاده از چندین crRNA

علاوه بر مزایای استفاده از کمپلکس Csm، SmLiveFISH از قابلیت Cas6 در پردازش pre-crRNAهای طولانی بهره می‌برد. این ویژگی برای دستیابی به حساسیت تک‌مولکولی مورد استفاده قرار گرفته است. با قرار دادن چندین crRNA در امتداد ناحیه 3′ UTR یک mRNA، نسبت سیگنال به نویز افزایش یافته است، به طوری که تنها 6 تا 12 crRNA برای تشخیص کافی بوده‌اند.

محدودیت احتمالی برای mRNAهای با ناحیه UTR کوتاه

لازم به ذکر است که SmLiveFISH ممکن است کاربرد محدودی برای mRNAهای با نواحی UTR کوتاه داشته باشد. از آنجایی که تقریباً از هر سه اسپیسر انتخاب شده به طور تصادفی، یکی دارای کارایی هدف‌گیری قوی است (احتمالاً به دلیل ساختار ثانویه و در دسترس بودن هدف)، احتمالاً می‌توان از تعداد کمتری اسپیسر استفاده کرد اگر آن‌ها با استفاده از روش‌های پیش‌بینی بیوانفورماتیکی انتخاب شوند یا ابتدا از نظر کارایی هدف‌گیری آزمایش و تأیید شوند.

ارائه پروتکل گام به گام برای ساخت آرایه‌های CRISPR بزرگ

در نهایت، یک پروتکل گام به گام برای ساخت آرایه‌های CRISPR بزرگ مورد استفاده در تصویربرداری SmLiveFISH ارائه شده است. این پروتکل می‌تواند برای محققانی که قصد استفاده از این روش را دارند، بسیار مفید باشد.

کاربردهای SmLiveFISH در مطالعه اختلالات عصبی

نقش پروتئین‌های متصل به RNA (RBPs) در اختلالات عصبی

جهش در RBPs در چندین اختلال عصبی از جمله پروتئین FMRP جهش یافته در سندرم X شکننده (FXS) و پروتئین TDP43 جهش یافته در اسکلروز جانبی آمیوتروفیک (ALS) نقش دارد.

نقش FMRP و TDP43 در تنظیم mRNA MAP1B

هر دو پروتئین FMRP و TDP43 در تنظیم انتقال، ترجمه و/یا پایداری mRNA *MAP1B* در نورون‌ها نقش دارند و تصور می‌شود که اختلال در تنظیم *MAP1B* و سایر mRNAهای هدف در بروز این بیماری‌ها نقش داشته باشد.

استفاده از SmLiveFISH به عنوان یک روش حساس برای بررسی مکانیسم‌های بیماری

SmLiveFISH اکنون می‌تواند به عنوان یک روش حساس برای بررسی چنین مکانیسم‌هایی به روش‌هایی که روش‌های تثبیت سلولی قادر به انجام آن نیستند، مانند اندازه‌گیری تغییرات در سرعت انتقال mRNA یا جابجایی گام به گام، استفاده شود. این تحلیل‌ها ممکن است به کشف مکانیسم‌های پاتولوژیک بیماری‌های مرتبط با RNA مانند FXS و ALS کمک کند.

رفتارهای متفاوت mRNAهای NOTCH2 و MAP1B پس از درمان با پوورومایسین

تشکیل گرانول‌های RNA بزرگ توسط MAP1B در ارتباط با P-bodies

پس از درمان با پوورومایسین، رفتارهای متفاوتی برای mRNAهای *NOTCH2* و *MAP1B* مشاهده شد. *MAP1B* در ارتباط با P-bodies گرانول‌های RNA بزرگ تشکیل داد، در حالی که *NOTCH2* این کار را نکرد.

یافته‌های مربوط به غنی‌شدگی mRNAهای خاص در P-bodies

نتایج توالی‌یابی قبلی برای mRNAهای جدا شده از P-bodies خالص شده از این یافته‌ها حمایت می‌کند. بر اساس این نتایج، mRNAهای کدکننده پروتئین‌های درگیر در تقسیم سلولی، تمایز و مورفوژنز در P-bodies غنی شده‌اند، در حالی که mRNAهای کدکننده پروتئین‌های غشای داخلی شبکه آندوپلاسمی در آن‌ها کمبود دارند.

پیشنهاد مسیرهای تجزیه متفاوت برای mRNAهای NOTCH2 و MAP1B

این یافته‌ها نشان می‌دهد که mRNAهای *NOTCH2* و *MAP1B* ممکن است به مسیرهای تجزیه متفاوتی متکی باشند که مکانیسم‌های مرتب‌سازی آن‌ها هنوز مشخص نشده است.

امکان توسعه سیستم‌های CRISPR–Cas نوع III متعامد

شناسایی توالی‌های خاص توسط زیرواحدهای Csm1 و Csm4

تحقیقات ساختاری در مورد سیستم‌های CRISPR–Cas نوع III نشان می‌دهد که زیرواحدهای Csm1 و Csm4 نوکلئوتیدهای (-6) و (-7) دسته 5′ crRNA را به روشی وابسته به توالی شناسایی می‌کنند.

امکان تصویربرداری RNA چندرنگ در سلول‌های زنده

بنابراین، ممکن است بتوان سیستم‌های CRISPR–Cas نوع III متعامد با حداقل تداخل با کمپلکس CRISPR–Csm نوع III-A از *S. thermophilus* مورد استفاده در این مطالعه را توسعه داد، که امکان تصویربرداری RNA چندرنگ در سلول‌های زنده را فراهم می‌کند. این روش می‌تواند برای پاسخ به سؤالات مربوط به تعاملات RNA–RNA، پیرایش و مونتاژ کمپلکس پروتئینی همزمان با ترجمه گسترش یابد.

چشم‌انداز و کاربردهای آتی SmLiveFISH

تسریع در مطالعه پویایی‌های فضایی-زمانی گونه‌های مختلف RNA

انتظار می‌رود که SmLiveFISH تلاش‌ها برای مطالعه پویایی‌های فضایی-زمانی گونه‌های مختلف RNA را در بسیاری از زمینه‌ها تسریع کند و کاربردهای فوری در زمینه‌های RNA، زیست‌شناسی سلولی و علوم اعصاب داشته باشد. این روش می‌تواند به محققان در درک بهتر نقش RNA در فرآیندهای بیولوژیکی مختلف و همچنین در توسعه درمان‌های جدید برای بیماری‌های مرتبط با RNA کمک کند.

منبع: Single-molecule live-cell RNA imaging with CRISPR–Csm