برای بررسی گستردگی تاثیر نانو توپوگرافی در ایجاد بازشدگی غشای هسته، محققان انواع مختلفی از سلول ها را مورد مطالعه قرار دادند. این سلول ها شامل سلول های اپیتلیالی (U2OS, HeLa, HEK-293)، سلول های بنیادی مشتق شده از قلب (siLMNA iPSC-CM) و سلول های فیبروبلاست (NIH-3T3) بودند. این سلول ها از نظر ساختار و شکل ظاهری، ویژگی های متفاوتی دارند.

نتایج نشان داد که تمامی انواع سلول های بررسی شده، بازشدگی غشای هسته ناشی از انحنا را در حضور نانوستون ها نشان دادند. در سلول های اپیتلیالی و سلول های بنیادی قلبی، بازشدگی غشای هسته با جابجایی پروتئین Ku-80 از هسته به سیتوپلاسم قابل مشاهده بود. در مقابل، در سلول های NIH-3T3، پروتئین Ku-80 به طور عمده در سیتوپلاسم قرار داشت. پس از ایجاد نقض غشای هسته توسط نانوستون ها، بخشی از Ku-80 به هسته منتقل شد.

این نتایج نشان می دهد که نانو توپوگرافی ها می توانند در انواع مختلف سلول، بازشدگی غشای هسته را القا کنند. همچنین، این نتایج نشان دهنده تبادل دو طرفه پروتئین ها بین هسته و سیتوپلاسم در زمان نقض غشای هسته است.

کنترل بازشدگی غشای هسته با تنظیم هندسه نانوستون و زمان تعامل

پس از اثبات توانایی نانو توپوگرافی ها در القای بازشدگی غشای هسته در انواع مختلف سلول، محققان به بررسی پویایی زمانی این پدیده پرداختند. آنها تعداد سلول های با غشای هسته نقض شده را در زمان های 1، 5 و 8 ساعت پس از کشت سلول های U2OS بر روی نانوستون ها اندازه گیری کردند.

نتایج نشان داد که در زمان 1 ساعت، درصد کمی از سلول ها بازشدگی غشای هسته را نشان می دهند. با گذشت زمان، میزان نقض غشا افزایش یافت. درصد سلول های با غشای هسته نقض شده از 6.5% در ساعت اول به 20.5% در ساعت پنجم رسید. بین ساعات 5 و 8، تغییر قابل توجهی در این درصد مشاهده نشد.

برای درک بهتر مکانیسم این پدیده، محققان از میکروسکوپ کانفوکال برای اندازه گیری عمق فرورفتگی و حداکثر انحنای غشای هسته در زمان های مختلف استفاده کردند. نتایج نشان داد که عمق فرورفتگی از 1.57 ± 0.19 میکرومتر در ساعت اول به 2.53 ± 0.24 میکرومتر در ساعت پنجم افزایش می یابد. بین ساعات 5 و 8، تغییر قابل توجهی در عمق فرورفتگی مشاهده نشد. این روند مشابه تغییرات درصد سلول های با غشای هسته نقض شده بود.

این نتایج نشان می دهد که عمق فرورفتگی بیشتر، با احتمال بالاتر نقض غشای هسته مرتبط است. عدم افزایش درصد سلول های با غشای هسته نقض شده بین ساعات 5 و 8، به دلیل عدم افزایش عمق فرورفتگی در این بازه زمانی، این فرضیه را تایید می کند.

علاوه بر این، میزان حداکثر انحنای غشای هسته به طور پیوسته از 0.65 ± 0.15 میکرومتر در ساعت اول به 1.59 ± 0.41 میکرومتر و 2.34 ± 0.84 میکرومتر در ساعت هشتم افزایش یافت. این نشان می دهد که قرار گرفتن طولانی مدت در معرض نانوستون ها، انحنا و تغییر شکل غشای هسته را افزایش می دهد. این افزایش انحنا و تغییر شکل، منجر به افزایش احتمال نقض غشای هسته می شود.

محققان همچنین به بررسی تاثیر گسترش سلول و هسته بر روی نانوستون ها بر میزان نقض غشای هسته پرداختند. آنها مساحت و شکل سلول و هسته را در زمان های 1، 5 و 8 ساعت اندازه گیری کردند.

مساحت سلول بین ساعات 1 و 5 تغییر چندانی نکرد. اما شکل سلول به طور قابل توجهی تغییر کرد. این تغییر شکل نشان دهنده تغییر شکل سلول در اطراف نانوستون ها در این بازه زمانی است. مهمتر از آن، تغییرات قابل توجهی در مساحت و شکل هسته بین ساعات 1 و 5 مشاهده شد. این تغییرات با افزایش میزان نقض غشای هسته همزمان بود. این شاخص ها بین ساعات 5 و 8 تغییر نکردند. این موضوع نشان می دهد که گسترش و تغییر شکل هسته، عامل کلیدی در نقض غشای هسته در حضور نانوستون ها است.

در حالی که مساحت و شکل سلول بین ساعات 5 و 8 به طور قابل توجهی تغییر کرد، این تغییرات با افزایش بیشتر در میزان نقض غشای هسته همبستگی نداشت. این یافته نشان می دهد که تغییرات در ابعاد و شکل هسته، نه تغییرات سلول، عامل اصلی در نقض غشای هسته در حضور نانوستون ها هستند.

در مجموع، این نتایج نشان می دهد که نقض غشای هسته به تعامل نزدیک بین سلول و نانوستون ها بستگی دارد. سطح نانوستون ها باید برای چسبندگی سلول و تغییر شکل آن در اطراف نانوستون ها مناسب باشد. همچنین، میزان نقض غشای هسته را می توان با تنظیم زمان تعامل بین نانوستون ها و سلول ها کنترل کرد.

مطالعات قبلی نشان داده اند که نانوستون های کوچکتر با قطر کمتر از 600 نانومتر و فاصله بیشتر از 3 میکرومتر، می توانند انحنای بیشتری در غشای هسته ایجاد کنند.

در این مطالعه، محققان به بررسی تاثیر اندازه نانوستون ها بر میزان نقض غشای هسته پرداختند. آنها با استفاده از اچ مرطوب ایزوتروپیک، ابعاد نانوستون ها را کاهش دادند و سایر عوامل را ثابت نگه داشتند. آنها درصد سلول های با غشای هسته نقض شده را بر روی نانوستون های بزرگ (ارتفاع 4.7 میکرومتر، قطر 1.30 میکرومتر) و کوچک (ارتفاع 3.18 میکرومتر، قطر 0.515 میکرومتر) مقایسه کردند.

نتایج نشان داد که با کاهش اندازه نانوستون ها، درصد سلول های با غشای هسته نقض شده از 12% به 78% افزایش می یابد. در مقابل، سطوح صاف هیچ نقضی را نشان ندادند. نانوستون های کوچکتر عمق فرورفتگی کمتری (2.58 میکرومتر) نسبت به نانوستون های بزرگتر (3.41 میکرومتر) ایجاد می کنند. با این حال، میزان حداکثر انحنای غشای هسته در نانوستون های کوچکتر (3.15 میکرومتر) به طور قابل توجهی بیشتر از نانوستون های بزرگتر (2.243 میکرومتر) بود.

به نظر می رسد انحنای بیشتر ایجاد شده توسط نانوستون های کوچکتر، عامل اصلی در افزایش میزان نقض غشای هسته باشد. با وجود اینکه نانوستون های بزرگتر فرورفتگی عمیق تری ایجاد می کنند، انحنای کمتر آنها منجر به کاهش میزان نقض غشا می شود. این یافته نشان می دهد که اگرچه عمق فرورفتگی در آسیب مکانیکی غشای هسته نقش دارد، اما میزان انحنا، عامل تعیین کننده اصلی در احتمال ایجاد بازشدگی در غشا است.

برای بررسی تاثیر تغییرات مساحت و شکل سلول و هسته بر میزان نقض غشای هسته در نانوستون های کوچکتر، این ویژگی ها در سلول ها مقایسه شدند. نتایج نشان داد که سلول های روی نانوستون ها، مساحت گسترش کمتری نسبت به سلول های روی سطوح صاف دارند. این تفاوت در مساحت گسترش، مستقل از اندازه نانوستون ها بود. تفاوت قابل توجهی در مساحت سلول بین نانوستون های کوچک و بزرگ مشاهده نشد.

همچنین، مشخص شد که گردی سلول و هسته، به جای مساحت گسترش، بین نانوستون های کوچک و بزرگ متفاوت است. این یافته نشان می دهد که شکل خاص سلول و هسته که توسط اندازه نانوستون ها ایجاد می شود، می تواند در نقض غشای هسته نقش داشته باشد.

ترمیم سریع غشای هسته پس از نقض ناشی از نانو توپوگرافی

در ادامه، محققان به بررسی موقتی بودن نقض غشای هسته ناشی از نانوستون ها پرداختند. با استفاده از تصویربرداری زنده از سلول هایی که پروتئین NLS-GFP را به عنوان گزارشگر پارگی هسته ای بیان می کردند، مشاهده شد که غشای هسته در حدود 1.5 ساعت پس از نقض، خود را ترمیم می کند.

فرآیند ترمیم با کاهش تدریجی نسبت NLS-GFP سیتوپلاسمی به هسته ای پس از نقض قابل مشاهده بود. پس از 1.5 ساعت، NLS-GFP به طور کامل به هسته بازگشت. این امر نشان دهنده موفقیت مکانیسم ترمیم است. همچنین، شروع رویداد پارگی با بیان موضعی پروتئین cGAS-mCherry همزمان بود. پروتئین cGAS-mCherry به DNA آزاد شده در سیتوپلاسم در محل نقض متصل می شود.

پروتئین cGAS حتی پس از ترمیم کامل غشای هسته و بازگشت NLS-GFP به هسته، در محل نقض باقی ماند. این یافته با مطالعات قبلی که حضور مداوم cGAS در محل های پارگی غشای هسته در سلول های سرطانی مهاجر را نشان داده بودند، مطابقت دارد.

در نهایت، با استفاده از میکروسکوپ دو فوتونی، محققان نشان دادند که ماشین آلات ترمیم ESCRT-III، به ویژه CHMP4B، به محل بازشدگی غشای هسته جذب شده و در ترمیم غشا نقش دارند.

در مجموع، این نتایج نشان می دهد که بازشدگی های غشای هسته ناشی از نانو توپوگرافی قابل ترمیم و موقتی هستند.

نتیجه گیری و چشم انداز آینده

غشای هسته به عنوان یک سد اصلی در تنظیم تبادل مولکولی بین سیتوپلاسم و هسته عمل می کند. عبور از این سد برای انتقال مواد به هسته سلول و کاربردهای حسگری داخل هسته ای بسیار مهم است. در این مطالعه نشان داده شد که نانو توپوگرافی می تواند به طور موقت غشای هسته انواع مختلف سلول را نقض کند. همچنین، با تنظیم هندسه و زمان تعامل نانوستون ها با سلول ها، می توان میزان نقض غشای هسته را کنترل کرد.

تحقیقات آینده بر انتقال مستقیم مولکول های زیستی مختلف به هسته سلول با استفاده از نانو توپوگرافی متمرکز خواهد شد. با قابلیت مشاهده مستقیم رویدادهای بازشدگی و ترمیم هسته، می توان این رویدادها را با رویدادهای انتقال مواد به هسته مرتبط کرد. این امر امکان طراحی هوشمندانه نانو توپوگرافی ها برای انتقال مواد به هسته در انواع مختلف سلول را فراهم می کند. نتایج این مطالعه نشان می دهد که این روش می تواند در انواع مختلف سلول برای کاربردهای درمانی گوناگون مورد استفاده قرار گیرد.

منبع: Engineered Nanotopographies Induce Transient Openings in the Nuclear Membrane