ثبت دائمی فعالیت آنزیم‌ها: ابزار جدید Kinprola انقلابی در درک سیگنال‌دهی سلولی

درک چگونگی ارتباط آبشارهای سیگنال‌دهی درون سلولی با عملکردهای عصبی در سیستم عصبی، یکی از حوزه‌های هیجان‌انگیز و پیچیده در علوم زیستی است. کینازها، به عنوان آنزیم‌های کلیدی در این آبشارها، با اضافه کردن گروه فسفات به پروتئین‌ها، نقش محوری ایفا می‌کنند. تا پیش از این، پژوهشگران عمدتاً از گزارشگرهای فعالیت کیناز فلورسنت با کدگذاری ژنتیکی استفاده می‌کردند تا فعالیت کینازها را به صورت لحظه‌ای (real-time) رصد کنند. اما این ابزارها، با وجود سودمندی‌شان، محدودیت‌هایی را به همراه دارند؛ به‌ویژه زمانی که نیاز به ثبت فعالیت کینازها با وضوح فضایی-زمانی بالا و به شکلی مقیاس‌پذیر، یا در بافت‌های عمیق حیوانات آزاد وجود دارد. این محدودیت‌ها عمدتاً به محدودیت‌های ذاتی میکروسکوپ نوری بازمی‌گردد.

در مواجهه با این چالش‌ها، گروهی از دانشمندان به دنبال راهبردی بوده‌اند که بتواند دوره ثبت فعالیت کیناز را از تحلیل آن جدا کند. ایده این بود که فعالیت‌های موقتی پروتئین کیناز را به یک “نشان دائمی” برای تحلیل‌های بعدی تبدیل کنند. برای دستیابی به این هدف، آن‌ها ابزاری نوآورانه به نام کینپرولا (Kinprola) را توسعه داده‌اند. کینپرولا یک رویکرد شیمی‌ژنتیک برای ثبت فعالیت پروتئین کیناز است که بر اساس سیستم تقسیم‌شونده HaloTag (split-HaloTag) که اخیراً توسط این گروه گزارش شده بود، بنا شده است. این ابزار جدید، با تبدیل یک سیگنال گذرا به یک نشان فلورسنت برگشت‌ناپذیر، محدودیت‌های روش‌های قدیمی را دور می‌زند.

کینپرولا چگونه کار می‌کند؟ الهام از سیستم‌های قدیمی، نوآوری در طراحی

اصل طراحی کینپرولا از گزارشگرهای فعالیت کیناز کلاسیک الهام گرفته شده است. در آن سیستم‌ها، اتصال برگشت‌پذیر یک پپتید سوبسترای فسفریله شده به یک دامنه اتصال فسفوآمینو اسید خاص، باعث نزدیک شدن دو پروتئین فلورسنت متصل به هم می‌شود که یک جفت FRET (انتقال انرژی تشدید فلورسنت) را تشکیل می‌دهند.

در کینپرولا، این دو پروتئین فلورسنت با دو جزء از یک سیستم تقسیم‌شونده HaloTag جایگزین شده‌اند. فسفریلاسیون کینپرولا سپس منجر به بازسازی HaloTag فعال می‌شود، که در حضور یک سوبسترای فلورسنت HaloTag، منجر به برچسب‌گذاری برگشت‌ناپذیر آن می‌گردد. بنابراین، نیاز به تاباندن نور برای رصد فعالیت با بیوسنسورهای فلورسنت، با تحویل یک سوبسترای فلورسنت جایگزین می‌شود.

ویژگی‌های کلیدی Kinprola:

• ثبت دائمی: کینپرولا در حضور هر دو (فعالیت یک پروتئین کیناز خاص و یک سوبسترای فلورسنت) یک نشان فلورسنت برگشت‌ناپذیر را انباشته می‌کند. این بدان معناست که داده‌ها پس از رویداد فعال‌سازی کیناز، “ثبت” می‌شوند و می‌توانند در زمان‌های بعدی تحلیل شوند.
• پنجره ضبط قابل تنظیم: پنجره زمانی ثبت با استفاده از سوبسترای فلورسنت قابل تنظیم است، معمولاً از چند دقیقه تا چند ساعت متغیر است. این انعطاف‌پذیری به پژوهشگران اجازه می‌دهد تا دوره‌های خاصی از فعالیت کیناز را مورد هدف قرار دهند.
• پاسخ سریع و ضبط متوالی: کینپرولا به سرعت به وضعیت فسفریلاسیون سلولی پاسخ می‌دهد و امکان ثبت متوالی فعالیت کیناز را در دوره‌های مختلف از طریق استفاده از سوبستراهای با طیف نوری متمایز فراهم می‌کند.
• کاربرد گسترده: کینپرولا در سیستم‌های مختلفی از جمله رده‌های سلولی کشت‌شده، نورون‌های اولیه، برش‌های مغزی و in vivo (در موجود زنده) قابل استفاده است.

طراحی ماژولار و گسترش‌پذیری کینپرولا

با استفاده از این اصل طراحی ماژولار، پژوهشگران توانسته‌اند گزارشگرهایی برای کینازهای مهمی مانند PKA، PKC، JNK و AMPK بسازند. این کار با جایگزینی پپتیدهای سوبسترای خاص که در مطالعات قبلی برای توسعه بیوسنسورهای بلادرنگ و انتخابی این کینازها شناسایی شده بودند، انجام شد. جایگاه‌های فسفریلاسیون و موتیف‌های شناسایی پپتیدهای سوبسترا، ویژگی بالا را برای کینازهای مربوطه تضمین می‌کنند و در عین حال واکنش متقابل (cross-reactivity) با سایر کینازها را به حداقل می‌رسانند.

کینپرولا می‌تواند برای ثبت فعالیت انواع دیگر کینازها، مانند ERK (Extracellular signal-regulated kinase) و کینازهای تیروزین (tyrosine kinases)، با استفاده از پپتیدهای سوبسترای مناسب و دامنه‌های اتصال فسفوآمینو اسید، گسترش یابد. همچنین، با برچسب‌گذاری با سیگنال‌های محلی‌سازی و پروتئین‌های فلورسنت متمایز، واریانت‌های KinprolaPKA می‌توانند برای ثبت همزمان فعال‌سازی PKA در بخش‌های سلولی متمایز در پاسخ به یک محرک مشابه استفاده شوند. در اصل، باید امکان ثبت فعالیت چندین کیناز با جداسازی فضایی واریانت‌های مناسب کینپرولا نیز وجود داشته باشد.

مزایای کلیدی کینپرولا: از نمونه‌های ثابت تا بررسی‌های مقیاس بزرگ

بیشتر آزمایش‌های گزارش شده در این مطالعه با KinprolaPKA انجام شده‌اند. یک ویژگی کلیدی KinprolaPKA، ماندگاری نشان فلورسنت است که برای روزها در نورون‌های زنده قابل تشخیص باقی می‌ماند و در برابر روش‌های تثبیت (fixation) مقاوم است. این امکان را فراهم می‌کند تا سلول‌ها بر اساس تاریخچه فعالیت کیناز خود از جمعیت‌های سلولی بزرگ و ناهمگن برای تحلیل‌های بعدی، تفکیک (sort) شوند.

کاربردهای برجسته Kinprola:

• تحلیل ترنسکریپتوم: تحلیل ترنسکریپتوم زیرجمعیت‌های سلولی GBC که بر اساس برچسب‌گذاری کینپرولا تفکیک شده‌اند، نقش مهم PKA در تنظیم چرخه سلولی را برجسته می‌کند، که به طور بالقوه با تکثیر و تهاجم گلیوبلاستوما (یک نوع تومور مغزی) همبستگی دارد.
• غربالگری CRISPR-knockout: علاوه بر این، یک غربالگری CRISPR-knockout مبتنی بر KinprolaPKA، رگولاتورهای غیرمتعارف متعددی را شناسایی کرد که بر فعالیت PKA تأثیر می‌گذارند. این می‌تواند درک ما از سیگنال‌دهی PKA را گسترش داده و به شناسایی اهداف درمانی کمک کند.
• تحلیل نمونه‌های ثابت و توان عملیاتی بالا: در مقایسه با بیوسنسورهای بلادرنگ، کینپرولا می‌تواند نمونه‌های ثابت را تحلیل کند، که با توان عملیاتی (throughput) بسیار بالاتری همراه است. بنابراین، کینپرولا همچنین برای غربالگری دارویی، در ترکیب با روش‌های با توان عملیاتی بالا مانند فلوسایتومتری و خوانشگرهای پلیت خودکار، بسیار مناسب است.
• تحلیل تک سلولی: برای تحلیل تک سلولی، کینپرولا می‌تواند مستقیماً با RNA-seq in situ یکپارچه شود و امکان ثبت پایدار فعالیت کیناز در کنار پروفایل بیان ژن تک سلولی در همان سلول‌ها را فراهم کند. این رویکرد می‌تواند به سایر تحلیل‌های اختلال تک سلولی، مانند غربالگری CRISPR مبتنی بر تصویربرداری با محتوای بالا نیز گسترش یابد.

ثبت دقیق و حساسیت بالا در محیط‌های چالش‌برانگیز

بیوسنسورهای فعالیت PKA بلادرنگ، کینتیک روشن شدن سریع فعالیت PKA را در پاسخ به ورودی‌های نورومودولاسیون نشان می‌دهند؛ با این حال، فاز خاموش شدن چندین دقیقه طول می‌کشد، که احتمالاً به دلیل جدا شدن آهسته cAMP از زیرواحدهای تنظیمی PKA است. در حضور سوبسترای HaloTag، KinprolaPKA به طور مداوم سیگنال‌های برچسب‌گذاری را در طول کل مدت یک یا چند چرخه فعال‌سازی PKA انباشته می‌کند.

پژوهشگران نشان داده‌اند که KinprolaPKA هم به اندازه کافی سریع و هم حساس است تا فعال‌سازی PKA را با وضوح در مقیاس دقیقه‌ای ثبت کند، حتی زمانی که توسط محرک‌های نسبتاً ضعیف و گذرا، مانند دوزهای پایین ایزوپرول یا تحریک الکتروفیزیولوژیکی در نورون‌های اولیه، تحریک می‌شود. سه پارامتر کلیدی – (۱) قدرت فعال‌سازی کیناز، (۲) غلظت سوبسترای HaloTag و (۳) زمان ثبت – درجه برچسب‌گذاری کینپرولا را تعیین می‌کنند. با تنظیم غلظت سوبسترا، کاربران کینپرولا می‌توانند پاسخگویی را برای مطابقت با نیازهای آزمایشی خاص خود به دقت تنظیم کنند.

کینپرولا همچنین یک ابزار امیدوارکننده برای ثبت فعالیت PKA in vivo است، همانطور که با برچسب‌گذاری KinprolaPKA در نورون‌های NAc (Nucleus Accumbens) با فعالیت PKA افزایش‌یافته که توسط یک آگونیست انتخابی D1/D5R در موش‌های آزاد تحریک شده بود، نشان داده شد. کینتیک پاکسازی سریع in vivo سوبستراهای فلورسنت HaloTag در موش‌ها (نیمه‌عمر حدود ۱۵ دقیقه) دوره ثبت KinprolaPKA را پس از یک تزریق واحد CPY-CA به مقیاس‌های زمانی دقیقه‌ای محدود می‌کند. بنابراین، گسترش دوره ثبت کینپرولا in vivo نیازمند روش‌های تحویل متفاوت سوبستراهای HaloTag یا توسعه سوبستراهای HaloTag با خواص فارماکوکینتیک مطلوب‌تر خواهد بود.

چشم‌انداز آینده: درک عمیق‌تر از نورومودولاسیون و کشف درمان‌ها

فعالیت PKA به عنوان یک جایگزین مرکزی برای نورومودولاسیون درون سلولی در سراسر سیستم عصبی نظارت شده است. بنابراین، کینپرولا باید به عنوان یک ابزار مکمل برای گزارشگرهای فعالیت PKA فلورسنت موجود برای تشریح مکانیسم‌های مرتبط با فعالیت نورومودولاتوری ex vivo و in vivo تبدیل شود.

در آینده، باید امکان علامت‌گذاری پایدار نورون‌ها با فعالیت PKA افزایش‌یافته با استفاده از کینپرولا در سیستم عصبی برای تحلیل ترنسکریپتوم و غربالگری‌های فارماکولوژیک یا ژنتیکی وجود داشته باشد. این امر مطالعات سیستماتیک ویژگی‌های مولکولی مسیرهای سیگنال‌دهی در طول نورومودولاسیون را امکان‌پذیر می‌سازد. به طور کلی، توسعه کینپرولا گامی مهم رو به جلو در توانمندسازی پژوهشگران برای درک پیچیدگی‌های سیگنال‌دهی سلولی با وضوح و مقیاس بی‌سابقه است، که راه را برای کشف‌های جدید و توسعه درمان‌های مؤثر هموار می‌کند.