کشف مکانیزم‌های پنهان: چگونه فعال‌سازی پایه ATR، چرخه‌ی تکثیر DNA را تنظیم می‌کند؟

در هر سلول زنده، فرآیند حیاتی تکثیر DNA (DNA replication) با دقت و ظرافت بی‌نظیری انجام می‌شود. این فرآیند پیچیده، که لازمه‌ی تقسیم سلولی و حفظ سلامت ژنوم است، تحت نظارت دقیق مجموعه‌ای از پروتئین‌ها و مسیرهای سیگنالینگ قرار دارد. یکی از این مسیرهای حیاتی، پاسخ به استرس تکثیر (Replication Stress Response – RSR) است که توسط کیناز ATR آغاز می‌شود. ATR (Ataxia-Telangiectasia and Rad3-related) به عنوان یک ناظر اصلی، سلامت ژنوم را در طول فاز S (فاز سنتز DNA) از چرخه‌ی سلولی تضمین می‌کند.

تاکنون، مکانیزم‌های فعال‌سازی RSR عمدتاً در مواجهه با استرس‌های بیرونی تکثیر، مانند عوامل آسیب‌رسان DNA، مورد بررسی قرار گرفته‌اند. این استرس‌ها منجر به جدا شدن هلیکاز CMG و DNA پلیمرازهای تکثیری می‌شوند که در نهایت به تجمع DNA تک رشته‌ای (ssDNA) منجر می‌گردد و ATR را فعال می‌کند. اما یک سوال مهم مطرح می‌شود: چگونه ATR در یک فاز S طبیعی و بدون آسیب نیز فعال می‌شود و نقش حیاتی در پیشبرد صحیح و کامل تکثیر DNA ایفا می‌کند؟ نکته جالب توجه این است که اهداف فسفریله شده توسط ATR در فاز S عادی، با پروتئین‌هایی که در حضور استرس تکثیر توسط ATR تغییر می‌یابند، متفاوت هستند. این تفاوت نشان می‌دهد که ATR دارای نقش‌های دوگانه‌ای است که فراتر از صرفاً پاسخ به آسیب عمل می‌کند.

به تازگی، گروهی از پژوهشگران به رهبری متخصصان برجسته در این حوزه، شواهد جدید و مهمی را در مورد مکانیزم فعال‌سازی پایه (basal activation) ATR در شرایط عادی تکثیر DNA ارائه کرده‌اند. یافته‌های آن‌ها پرده از یک سازوکار پیچیده و دقیق برمی‌دارد که نه تنها نحوه تنظیم سرعت تکثیر DNA را مشخص می‌کند، بلکه بینش‌های جدیدی را در مورد پتانسیل هدف‌گیری این مسیر در درمان‌هایی مانند سرطان فراهم می‌آورد.

نقش محدودکننده ATR در شروع تکثیر DNA

گزارش‌های اولیه نشان دادند که مهار ATR و CHK1 (پروتئین کیناز چکینت) سرعت تکثیر DNA را افزایش می‌دهد. این مشاهده منجر به این پیشنهاد شد که فعال‌سازی پایه RSR، شروع به کار مبدأهای تکثیر (origin firing) را محدود می‌کند تا از کاهش ناگهانی منابع لازم در طول تکثیر DNA جلوگیری شود. بعدها مشخص شد که فعال‌سازی تعداد محدودی از مولکول‌های ATR از فسفریلاسیون MCM4 و کمپلکس GINS توسط CDC7 جلوگیری می‌کند. این فرآیند، شروع به کار مبدأهای جدید را هم به صورت موضعی و هم در اواخر فاز S مهار می‌کند.

جالب اینجاست که مهار ATR در غیاب آسیب، تعداد مبدأهای فعال و چنگال‌های تکثیر (replication forks) را افزایش می‌دهد، اما این افزایش به قیمت کاهش سرعت چنگال و تجمع چنگال‌های فروریخته (collapsed forks) تمام می‌شود. در راستای این نتایج، کارهای اخیر نشان داده‌اند که حذف ATR تأثیری بر شروع تکثیر DNA ندارد، اما در سلول‌های B منجر به شکست تکثیر در میانه فاز S می‌شود. در این مدل، مهار شروع به کار مبدأها می‌تواند کمبود نوکلئوتیدها را جبران کرده و از آسیب DNA ناشی از نبود ATR جلوگیری کند.

بنابراین، فعالیت پایه ATR تعداد مبدأهایی را که به طور همزمان در غیاب استرس تکثیر فعال می‌شوند، محدود می‌کند تا پیشرفت صحیح تکثیر DNA تضمین شود و از اتمام عوامل تکثیر و نوکلئوتیدها جلوگیری به عمل آید. اگرچه یک کار اخیر، سطح پایه فعالیت ATR را با تجمع RPA (Replication Protein A) در طول تکثیر DNA مرتبط دانسته است، اما مکانیزم‌هایی که فعالیت پایه ATR را تنظیم می‌کنند، تا حد زیادی ناشناخته باقی مانده بودند.

کشف مکانیزم فعال‌سازی پایه ATR: نقش POLA/PRIM و VCP/p97

پژوهشگران در مطالعه جدید خود، شواهد قانع‌کننده‌ای ارائه کرده‌اند که نشان می‌دهد فعال‌سازی پایه ATR توسط بارگذاری POLA/PRIM بر روی کروماتین و تولید DNA آغازگر (primed DNA) هدایت می‌شود و توسط استخراج این کمپلکس توسط VCP/p97 محدود می‌گردد. این مدل بر اساس چندین خط از شواهد قوی پشتیبانی می‌شود:

1. فعال‌سازی ATR توسط مهارکننده VCP (VCPi) و وابستگی به TOPBP1: مشاهده شد که مهارکننده‌های VCP (VCPi) ATR را به روشی وابسته به TOPBP1 (Topoisomerase II Binding Protein 1) فعال می‌کنند. از آنجایی که TOPBP1 در حضور ساختارهای DNA آغازگر بارگذاری می‌شود، این یافته نشان می‌دهد که در صورت مسدود شدن VCP/p97، ساختارهای DNA آغازگر انباشته می‌شوند.
2. نیاز به فعالیت کاتالیزوری POLA/PRIM برای فعال‌سازی CHK1 توسط VCPi: فعال‌سازی CHK1 توسط VCPi نیازمند فعالیت کاتالیزوری POLA/PRIM (DNA Polymerase Alpha/Primase) است. مهار کامل POLA1، فعال‌سازی CHK1 در حضور VCPi را از بین می‌برد.
3. تجمع قطعات اوکازاکی و DNA آغازگر با VCPi: مهار VCPi منجر به تجمع قطعات اوکازاکی و DNA آغازگر می‌شود، که اثبات می‌کند استخراج POLA/PRIM توسط VCP/p97، فرآیند آغازگری (priming) را محدود می‌کند، به احتمال زیاد در رشته پیرو (lagging strand).
4. اثر مهار شروع به کار مبدأ بر فعال‌سازی CHK1: مهار شروع به کار مبدأها به طور جزئی از فعال‌سازی CHK1 ناشی از VCPi جلوگیری می‌کند. این امر نشان می‌دهد که VCP/p97 فرآیند آغازگری را هم پس از شروع به کار مبدأها و هم در چنگال‌های تکثیر DNA در حال پیشرفت کنترل می‌کند.

این یافته‌ها همچنین روشن کردند که در این زمینه، رویدادهای آغازگری به POLA/PRIM مرتبط هستند و نه به PRIMPOL. حذف ژنتیکی PRIMPOL تأثیری بر اثر مهار VCP/p97 بر تکثیر DNA نداشت. این با گزارش اخیر مطابقت دارد که نشان می‌دهد فعال‌سازی آغازگری مجدد توسط PRIMPOL نیازمند فسفریلاسیون آن توسط CHK1 است که تنها از طریق بیان بیش از حد Claspin که CHK1 را فعال می‌کند، حاصل می‌شود.

پیوند POLA/PRIM با هلیکاز CMG و تنظیم آغازگری

داده‌های ساختاری و بیوشیمیایی اخیر نیز به مکانیزم‌های آغازگری توسط کمپلکس POLA/PRIM در طول تکثیر DNA نور تابانده‌اند. علاوه بر برهم‌کنش گزارش شده قبلی با Ctf4/AND1، کمپلکس POLA/PRIM مستقیماً از طریق برهم‌کنش با پروتئین‌های MCM با هلیکاز CMG ارتباط برقرار می‌کند و در موقعیتی قرار می‌گیرد که رشته پیرو را مستقیماً پس از باز شدن DNA جای دهد. این آرایش امکان سنتز RNA آغازگر را فراهم می‌کند که توسط POLA1 با پیشروی رپلیزوم (replisome) طویل می‌شود.

پایداری ارتباط بین POLA/PRIM و CMG کاملاً مشخص نیست. محدود کردن میزان POLA/PRIM منجر به قطعات اوکازاکی طولانی‌تر می‌شود، که به نفع یک مدل توزیعی (distributive model) است که در آن آغازگری توسط POLA/PRIM شامل اتصال و جداسازی کمپلکس از کروماتین است. در توافق با مدل توزیعی، پژوهشگران نشان دادند که تنظیم اتصال POLA/PRIM به کروماتین، فرآیند آغازگری DNA را در طول تکثیر محدود می‌کند. داده‌های آن‌ها همچنین از این ایده حمایت می‌کند که تعداد ساختارهای DNA آغازگر یک عامل مهم برای تنظیم سطح پایه فعال‌سازی ATR/CHK1 است. در واقع، قبلاً نشان داده شده بود که مهار بلوغ قطعات اوکازاکی با القای تجمع DNA آغازگر، RSR را فعال می‌کند.

این مطالعه نشان می‌دهد که VCP/p97 در شرایط عادی POLA/PRIM را از کروماتین استخراج می‌کند، که باعث محدود شدن تولید ساختارهای DNA آغازگر می‌شود و از فعال‌سازی بیش از حد ATR جلوگیری می‌کند. فعال‌سازی بیش از حد ATR، پیشرفت از طریق چرخه سلولی را مختل خواهد کرد. البته پژوهشگران امکان سهم اضافی VCP/p97 در بلوغ قطعات اوکازاکی را رد نمی‌کنند، که می‌تواند موضوع بسیار جالبی برای آزمایش‌های آینده باشد.

نقش‌های دیگر POLA/PRIM و پیامدهای درمانی مهار VCP/p97

کمپلکس POLA/PRIM علاوه بر سنتز آغازگرها در رشته پیرو در طول تکثیر DNA، در سایر فرآیندهای سلولی نیز نقش دارد. این شامل گسترش تلومرها به عنوان بخشی از کمپلکس CST، فعالیت پرکنندگی (fill-in) در NHEJ (Non-Homologous End Joining)، وراثت هیستون‌ها در طول تکثیر DNA با همکاری MCM2 و AND1، و همچنین به چنگال‌های متوقف شده از طریق برهم‌کنش با RAD51 جذب می‌شود.

نتایج این مطالعه در مورد تجمع POLA/PRIM بر روی کروماتین در صورت مهار VCP/p97 نشان می‌دهد که تنها بخشی از این کمپلکس توسط استخراج با واسطه VCP/p97 کنترل می‌شود، که نشان‌دهنده وجود مکانیزم‌های مختلف اتصال POLA/PRIM به کروماتین است. به همین ترتیب، Ctf4/AND1 تنها زمانی بر طول قطعه اوکازاکی تأثیر می‌گذارد که میزان POLA/PRIM کاهش یابد و برای برهم‌کنش کمپلکس با هلیکاز CMG ضروری نیست. این نشان می‌دهد که مکانیزم‌های خاصی وجود دارند که POLA/PRIM را در زمینه‌های خاص به کروماتین جذب می‌کنند. پژوهشگران فرض می‌کنند که اتصال پایدار به رپلیزوم ممکن است برای وراثت صحیح وضعیت‌های کروماتین ضروری باشد، در حالی که یک بخش متحرک‌تر از POLA/PRIM که توسط VCP/p97 کنترل می‌شود، تنظیم پویا تعداد قطعات اوکازاکی تولید شده در طول تکثیر DNA را امکان‌پذیر می‌سازد.

بر اساس مدل ارائه شده، مهار VCP/p97 باید منجر به تجمع ساختارهای آغازگر و فسفریلاسیون متعاقب CHK1، فعال‌سازی چکینت و توقف چرخه سلولی در G2/M شود. قبلاً پیشنهاد شده بود که توقف G2/M ناشی از VCPi به تجمع پروتئین‌های تکثیر روی کروماتین به دلیل مهار جداسازی رپلیزوم پس از پایان تکثیر DNA مربوط می‌شود. در این راستا، یک مطالعه اخیر نشان داده است که جداسازی رپلیزوم در فاز S برای بازیافت عوامل تکثیر DNA ضروری است. حذف لیگاز یوبی‌کویتین E3 که رپلیزوم را برای استخراج توسط VCP/p97 علامت‌گذاری می‌کند، چکینت G2/M را فعال می‌کند. با این حال، آن مطالعه بررسی نکرد که آیا خود مهار VCP/p97 چنین اثری را القا می‌کند یا خیر. پژوهشگران در این مطالعه نشان دادند که یک مهار کوتاه مدت VCP/p97 هنوز چکینت را بدون القای تجمع عمومی عوامل تکثیر فعال می‌کند. بنابراین، فعال‌سازی چکینت با درمان کوتاه مدت VCPi، به احتمال زیاد پیامد افزایش فسفریلاسیون پایه CHK1 به دلیل افزایش آغازگری است، در حالی که تجمع رپلیزوم‌های جدا نشده در اواخر فاز S پس از درمان‌های طولانی‌تر مرتبط خواهد بود.

جالب اینجاست که داده‌های این مطالعه همچنین نشان می‌دهد که VCP/p97 به طور مستقیم پیشرفت چنگال تکثیر را کنترل می‌کند. آن‌ها نشان دادند که فعالیت VCP/p97 برای حفظ نرخ فیزیولوژیکی چنگال به روشی وابسته به POLA/PRIM ضروری است و این اثر می‌تواند توسط چندین مکانیزم واسطه‌گری شود. اول، حذف POLA/PRIM توسط VCP/p97 می‌تواند تغییر به DNA پلیمرازهای δ و ε را تسهیل کند تا امکان پیشرفت از آغاز به طویل شدن را فراهم کند. دوم، VCP/p97 می‌تواند برای بازیافت سایر عوامل محدودکننده تکثیر، همانطور که کارهای اخیر پیشنهاد کرده‌اند، مورد نیاز باشد. در نهایت، VCPi می‌تواند منجر به جدا شدن رشته‌های پیشرو و پیرو شود. آزمایش‌های بیشتر برای درک کامل چگونگی تعیین دینامیک تکثیر DNA توسط VCP/p97 و شناسایی کوفاکتورهایی که در هر یک از این فرآیندها شرکت می‌کنند، مورد نیاز خواهد بود.

فعال‌سازی پایه مسیر ATR/CHK1 در طول فاز S، مبدأهای اواخر فاز S را کنترل می‌کند. در این راستا، قبلاً فرض شده بود که فعال‌سازی مبدأ سیگنالی است که به صورت موضعی از شروع به کار مبدأهای پشتیبان جلوگیری می‌کند. در این مطالعه، شواهدی ارائه شد که نشان می‌دهد، نه تنها تعداد مبدأهای فعال مهم است، بلکه آغازگری توسط POLA/PRIM نیز سطح فعالیت پایه ATR/CHK1 را کنترل می‌کند.

اثرات مهارکننده‌های VCP/p97 بر تکثیر DNA برای کاربرد آن‌ها در درمان سرطان مهم است. مهار VCP/p97 در ابتدا برای القای مرگ سلول‌های سرطانی از طریق افزایش استرس پروتئوتوکسیک پیشنهاد شد. با این حال، داده‌های اخیر نشان می‌دهد که عمل سیتوتوکسیک VCPi با کنترل تکثیر DNA و ترمیم، از طریق القای افزایش به دام افتادن PARP1 یا تغییر انتخاب مسیر ترمیم DNA مرتبط است. علاوه بر این، داروی ضد سوء مصرف الکل دیسولفیرام، آداپتور VCP/p97 به نام NPL4 را هدف قرار می‌دهد و در RSR تداخل ایجاد می‌کند تا از توسعه سرطان جلوگیری کند.

نتیجه‌گیری: یک مدل نوین برای تنظیم تکثیر DNA

به طور خلاصه، این مطالعه مدل جدیدی را پیشنهاد می‌کند که در آن VCP/p97 میزان POLA/PRIM را بر روی کروماتین محدود می‌کند، که تولید قطعات اوکازاکی را محدود کرده و فعالیت پایه ATR/CHK1 را تنظیم می‌نماید. نتایج آن‌ها از مدلی حمایت می‌کند که در آن مجموعه‌ای از POLA/PRIM به روشی توزیعی با کروماتین مرتبط می‌شود و به عنوان یک حسگر پیشرفت تکثیر DNA عمل می‌کند تا در غیاب آسیب، سرعت شروع به کار مبدأها و سرعت پیشرفت فاز S را بدون ایجاد ناپایداری ژنومی تنظیم کند.

این کشف یک بینش اساسی در مورد چگونگی تنظیم دقیق و ظریف یکی از حیاتی‌ترین فرآیندهای سلولی در غیاب آسیب ژنومی ارائه می‌دهد. درک این مکانیزم‌های پایه نه تنها به ما کمک می‌کند تا سلامت سلولی را بهتر درک کنیم، بلکه مسیرهای جدیدی را برای توسعه درمان‌های هدفمند برای بیماری‌هایی مانند سرطان، که اغلب با اختلال در کنترل تکثیر DNA همراه هستند، باز می‌کند. آینده‌ی پژوهش در این حوزه، وعده‌ی کشف جزئیات بیشتری از این شبکه نظارتی پیچیده و کاربردهای درمانی آن را می‌دهد.

منبع :

DNA polymerase α/primase extraction from chromatin by VCP/p97 restricts ATR activation during unperturbed DNA replication