راز افزایش دقت CRISPR/Cas9: چگونه مهندسی ظریف پروتئین، آینده ویرایش ژن را شکل می‌دهد؟

ویرایش ژن با استفاده از ابزار قدرتمند CRISPR/Cas9، انقلابی در زیست‌شناسی و پزشکی ایجاد کرده است. این تکنیک، که به دانشمندان اجازه می‌دهد تا با دقت بی‌سابقه‌ای در DNA دستکاری کنند، پتانسیل عظیمی برای درمان بیماری‌ها و درک عمیق‌تر از عملکرد ژن‌ها دارد. با این حال، همانند هر فناوری پیشرفته‌ای، CRISPR/Cas9 نیز با چالش‌هایی روبرو است. یکی از مهم‌ترین این چالش‌ها، پدیده “برش‌های خارج از هدف” (off-target cleavage events) است. این برش‌های ناخواسته، که به دلیل عدم تطابق‌های جزئی بین RNA راهنما و DNA هدف رخ می‌دهند، می‌توانند عواقب ناخواسته‌ای داشته باشند و ایمنی و دقت کاربردهای درمانی را به خطر بیندازند.

پژوهشگران در سراسر جهان به دنبال راهبردهای مختلفی برای افزایش دقت سیستم CRISPR/Cas9 هستند. یکی از این رویکردهای نویدبخش، مهندسی دقیق پروتئین Cas9 از طریق ایجاد جهش‌های خاص است. اخیراً، یک مطالعه جامع بر روی این موضوع متمرکز شده و با استفاده از شبیه‌سازی‌های پیشرفته دینامیک مولکولی، به بینش‌های عمیقی در مورد چگونگی تأثیر این جهش‌ها بر عملکرد Cas9 دست یافته است. این پژوهش، که نگاهی دقیق به تعاملات ظریف بین پروتئین Cas9 و DNA دارد، پرده از سازوکارهایی برمی‌دارد که می‌توانند راه را برای ساخت سیستم‌های CRISPR/Cas9 ایمن‌تر و دقیق‌تر هموار کنند.

هدف‌گذاری هوشمندانه: کاهش بار مثبت در Cas9

رویکرد اصلی که در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفت، شامل ایجاد جهش‌هایی در باقی‌مانده‌های آمینواسیدی با بار مثبت و حفاظت‌شده در مرز نوکلئازهای HNH/RuvCIII پروتئین Cas9 است. این بخش‌ها از Cas9 برای فعالیت برش DNA حیاتی هستند. منطق پشت این جهش‌ها نسبتاً ساده اما هوشمندانه است:

DNA دارای اسکلتی با بار منفی است. نوکلئاز Cas9، به دلیل وجود باقی‌مانده‌های مثبت در این مرزها، جذب الکترواستاتیکی قوی با DNA برقرار می‌کند. فرضیه این است که با کاهش بار مثبت در این نواحی، می‌توان نیروی جذب الکترواستاتیکی بین Cas9 و اسکلت DNA غیرهدف (ntDNA) را تضعیف کرد. این تضعیف، به نوبه خود، باعث می‌شود که رشته‌های DNA در جایی که هیبرید RNA/DNA دارای عدم تطابق‌های نامطلوب انرژی‌زا (یعنی عدم تطابق‌های خارج از هدف) است، راحت‌تر از هم جدا شوند و دوباره با هم جفت شوند (rehybridization). این فرآیند جداسازی مجدد، احتمالاً برش‌های خارج از هدف را به حداقل می‌رساند و به سیستم اجازه می‌دهد تا تنها اهداف کاملاً منطبق را برش دهد. نقشه‌های پتانسیل الکترواستاتیکی که از شبیه‌سازی‌ها به دست آمده‌اند، این فرضیه اولیه را تأیید کرده‌اند.

بررسی دقیق در سطح مولکولی: کاوش دینامیک‌های پیچیده

برای بررسی این فرضیه، پژوهشگران یک تحلیل جامع از مسیرهای دینامیک مولکولی (MD) را بر روی مجموعه‌های سه‌تایی CRISPR/Cas9/DNA انجام دادند. این مجموعه‌ها شامل پروتئین Cas9 (هم نوع وحشی (wt) و هم پروتئین‌های جهش‌یافته با تغییرات هدفمند در باقی‌مانده‌های مثبت حفاظت‌شده در مرز HNH/RuvCIII)، RNA راهنمای منفرد (sgRNA)، رشته DNA هدف (tDNA) و رشته DNA غیرهدف کشیده‌شده (ntDNA) بودند.

تمرکز اصلی این تحقیق بر درک تأثیر جهش‌های پروتئینی بر ساختار و آرایش فضایی نسبی بین Cas9 و رشته ntDNA بود. به عبارت دیگر، آن‌ها می‌خواستند ببینند که چگونه تغییرات کوچک در Cas9 می‌تواند بر نحوه تعامل آن با DNA غیرهدف تأثیر بگذارد، که این امر برای درک مکانیسم کاهش برش‌های خارج از هدف بسیار مهم است.

تغییرات ساختاری ظریف با اثرات غیرمستقیم

یکی از یافته‌های مهم این تحلیل، تغییرات ساختاری در ntDNA در مجموعه‌های جهش‌یافته بود. این تغییرات منجر به افزایش فاصله بین ntDNA و باقی‌مانده‌های HNH/RuvCIII شد. این افزایش فاصله به عنوان نشانه‌ای از تضعیف برهم‌کنش بین پروتئین و DNA غیرهدف تلقی می‌شود.

نکته جالب توجه این بود که الگوهای مشاهده‌شده در تغییرات فاصله پروتئین-ntDNA، اثرات غیرموضعی (nonlocal effects) را نشان دادند. به عبارت ساده‌تر، جهش‌ها در باقی‌مانده‌های خاصی از Cas9 به طور مستقیم بر فاصله خود آن باقی‌مانده‌ها از ntDNA تأثیر نمی‌گذاشتند. در عوض، جهش‌های بررسی شده اثر غیرمستقیمی بر فاصله ntDNA در ناحیه دور از PAM (PAM-distal ntDNA) از سایر باقی‌مانده‌های بومی (native) در مرز HNH/RuvCIII داشتند. این پدیده به عنوان حرکات آلوستریک ناشی از جهش (mutation-induced allosteric motions) شناخته می‌شود؛ جایی که تغییر در یک نقطه از پروتئین، باعث تغییرات ساختاری یا دینامیکی در نقطه‌ای دورتر می‌شود که منجر به کاهش برهم‌کنش Cas9-ntDNA می‌شود.

اگرچه این مطالعه به دنبال درک عمیق مکانیسم‌های آلوستریک نبود و آن‌ها را صرفاً به عنوان مشاهدات ارائه کرده است، اما این یافته فرضیه اصلی را تضعیف نمی‌کند: جهش‌های Cas9 تعادل برهم‌کنش بین بخش‌های مختلف کمپلکس CRISPR/Cas9 متصل به DNA را تغییر می‌دهند.

کاهش پیوندهای هیدروژنی: تأثیر بر برش DNA غیرهدف

بررسی دقیق‌تر مسیرهای شبیه‌سازی همچنین تأثیرات ناشی از جهش بر الگوهای پیوندهای هیدروژنی (H-bond patterns) را آشکار کرد. به‌طور خاص، محققان نشان دادند که تعداد پیوندهای هیدروژنی بین رشته ntDNA و دامنه RuvCIII در پروتئین‌های جهش‌یافته نسبت به Cas9 نوع وحشی کاهش می‌یابد. این کاهش در تعداد پیوندهای هیدروژنی بسیار قابل توجه است، زیرا دامنه RuvCIII دقیقاً همان بخشی از Cas9 است که مسئول برش رشته ntDNA است. کاهش این پیوندها می‌تواند توضیح دهد که چرا تمایل Cas9 برای برش DNA غیرهدف کاهش می‌یابد.

با این حال، داده‌های این مطالعه همبستگی مستقیمی بین تشکیل/اختلال در پیوندهای هیدروژنی و تغییرات در ویژگی (specificity) را نشان ندادند. این موضوع نشان می‌دهد که مکانیسم‌های دخیل در افزایش ویژگی پیچیده‌تر هستند و تنها به تعداد پیوندهای هیدروژنی در یک ناحیه خاص محدود نمی‌شوند.

اهمیت تعادل انرژی: مهندسی سیستم‌های کارآمدتر

در مجموع، نتایج این کار پژوهشی، فرضیه‌ای را تقویت می‌کند که بیان می‌دارد جهش‌های پروتئینی، تعادل انرژی بین بخش‌های مختلف کمپلکس‌های CRISPR/Cas9 متصل به DNA را تنظیم می‌کنند. از آنجایی که تعادل انرژی یک عامل کلیدی در عملکرد سیستم‌های ترکیبی مانند کمپلکس CRISPR/Cas9 متصل به DNA است، این راهبرد می‌تواند برای مهندسی سیستم‌های کارآمدتر و به‌ویژه سیستم‌های با ویژگی بالاتر مفید باشد.

در حال حاضر، راهبردهای دیگری نیز برای افزایش ویژگی CRISPR/Cas9 در حال بررسی هستند، و جامعه علمی هنوز به مرحله‌ای نرسیده است که بتوان هر یک از این رویکردها را حذف کرد. در واقع، احتمالاً ترکیب رویکردهای مختلف در نهایت می‌تواند سودمندترین نتایج را به همراه داشته باشد.

مطالعات آینده که هدفشان بررسی چشم‌اندازهای انرژی (energy landscapes) با استفاده از روش‌های نمونه‌برداری شتاب‌یافته مانند متادینامیک است، می‌توانند در روشن کردن هرچه بیشتر چگونگی تأثیر تغییرات ناشی از جهش بر برهم‌کنش‌های الکترواستاتیکی و تعیین مسیرهای انرژی آزاد که در نهایت پایداری و عملکرد سیستم را کنترل می‌کنند، کمک کنند. این گام‌ها برای پیشرفت در فناوری‌های ویرایش ژن حیاتی هستند و نویدبخش آینده‌ای هستند که در آن CRISPR/Cas9 با دقت و ایمنی بیشتری برای کاربردهای درمانی مورد استفاده قرار گیرد. این پژوهش، نمونه‌ای درخشان از این است که چگونه درک دقیق از مکانیک مولکولی می‌تواند به پیشرفت‌های تکنولوژیکی در زیست‌شناسی کمک کند.

منبع :

Probing Electrostatic Interactions in DNA-Bound CRISPR/Cas9 Complexes by Molecular Dynamics Simulations