مهندسی باکتری‌ها برای حداکثرسازی انتقال الکترون

در دنیای امروز که نیاز به انرژی‌های پاک و پایدار بیش از هر زمان دیگری احساس می‌شود، میکروارگانیسم‌های تولیدکننده برق یا “اگزوالکتروژن‌ها” (exoelectrogens) توجه ویژه‌ای را به خود جلب کرده‌اند. این باکتری‌های منحصربه‌فرد، قادرند الکترون‌ها را از طریق فرآیندهای متابولیکی خود به خارج از سلول منتقل کرده و به یک الکترود رسانا برسانند و به این ترتیب، برق تولید کنند. این فرآیند، که به عنوان انتقال الکترون خارج سلولی (Extracellular Electron Transfer – EET) شناخته می‌شود، پتانسیل عظیمی برای کاربردهایی نظیر تولید برق از فاضلاب، بیوسنسورها و حتی سوخت‌های زیستی دارد.

در میان اگزوالکتروژن‌ها، باکتری Shewanella oneidensis MR-1 به دلیل توانایی‌های طبیعی خود در EET، به یک مدل محبوب در تحقیقات تبدیل شده است. با این حال، دستیابی به حداکثر کارایی EET در این باکتری، نیازمند بهینه‌سازی دقیق است. یک گروه از پژوهشگران، با رویکردی نوآورانه در مهندسی متابولیک و زیست‌شناسی مصنوعی، توانسته‌اند گام‌های بلندی در این مسیر بردارند. آنها بر روی یک مولکول کلیدی به نام فنازین-۱-کربوکسیلیک اسید (PCA) متمرکز شده‌اند، که به عنوان یک “شاتل الکترونی” (electron shuttle) عمل کرده و به انتقال الکترون‌ها از باکتری به الکترود کمک می‌کند. در این گزارش، به تفصیل به دستاوردهای چشمگیر این محققان در بهینه‌سازی تولید و انتقال PCA برای افزایش بی‌سابقه EET در S. oneidensis MR-1 خواهیم پرداخت.

الهام از طبیعت: یافتن بهترین شاتل الکترونی

پژوهشگران ابتدا به این نتیجه رسیدند که افزودن PCA به محیط کشت در غلظت تقریباً ۸۰ میکرو مولار (µM)، منجر به بالاترین میزان تولید برق در S. oneidensis MR-1 در مقایسه با سایر شاتل‌های الکترونی رایج (مانند فلاوین‌ها و کینون‌ها) می‌شود. این مشاهده مهم، جرقه اولیه برای یک پروژه بلندپروازانه را زد: برنامه‌ریزی یک مسیر EET با واسطه PCA در S. oneidensis MR-1 از طریق مهندسی دقیق. این هدف با سه رویکرد اصلی دنبال شد:

1. مهندسی مسیر بیوسنتز de novo PCA: یعنی ساختن مسیر تولید PCA از پایه در باکتری.
2. تسهیل انتقال PCA: افزایش خروج PCA از سلول به محیط خارجی.
3. جدا کردن پویا (dynamically decoupling) بیوسنتز و انتقال PCA: بهینه‌سازی زمان‌بندی و سطوح تولید و خروج PCA.

تیم تحقیقاتی با این تلاش‌ها، به یک افزایش قابل توجه در EET در سویه مهندسی‌شده خود، SDV3، دست یافت. آن‌ها همچنین تحلیل‌های جامعی از الکتروفیزیولوژی سلولی، متابولیسم و رفتار باکتری انجام دادند تا مکانیسم‌های اساسی این افزایش EET با واسطه PCA را روشن کنند.

ساخت مسیر بیوسنتز PCA: از انتخاب ژن تا بهینه‌سازی پروموتر

برای دستیابی به سطح بهینه PCA (حدود ۸۰ µM) در S. oneidensis MR-1، گام اول شامل شناسایی و کلون‌سازی ۱۱ اپرون بیوسنتز PCA از منابع مختلف (مانند Pseudomonas aeruginosa PAO1) به صورت مجزا در S. oneidensis MR-1 بود. از میان این ۱۱ سویه مهندسی‌شده، سویه SC7 (که دارای اپرون phzABCDEFG از P. aeruginosa PAO1 تحت کنترل پروموتر PlacUV5 بود) بهترین عملکرد را نشان داد.

سویه SC7: نقطه آغازین موفقیت

سویه SC7 توانست بالاترین سطح PCA، معادل ۷۶ ± ۸.۷۲ میکرو مولار، را تولید کند. این میزان تولید PCA به طور مستقیم با نرخ EET بالاتر و حداکثر چگالی توان ۴۶ ± ۱۱۸۵.۹۳ میلی‌وات بر متر مربع (mW m−2) همراه بود. این چگالی توان، ۰۷/۱۴ برابر بیشتر از سویه وحشی (WT) بود که تنها ۵۳ ± ۸۴.۳۰ میلی‌وات بر متر مربع تولید می‌کرد. این نتیجه اولیه، اهمیت بیوسنتز درونی PCA را در افزایش EET به وضوح نشان داد.

بهینه‌سازی پروموتر برای افزایش تولید PCA

برای اینکه سطح سنتز PCA را از ۸.۷۲ میکرو مولار فراتر ببرند و آن را به غلظت بهینه (~۸۰ میکرو مولار) نزدیک کنند، پژوهشگران سه پروموتر مختلف شامل Pae، Pxyl و Ptac را به صورت جداگانه در سویه SC7 جایگزین پروموتر PlacUV5 کردند. این جایگزینی منجر به تولید سه سویه نوترکیب جدید به نام‌های SO1 تا SO3 شد.

به طور قابل توجهی، سویه SO3 (با پروموتر Ptac متصل به اپرون phzABCDEFG) توانست PCA را در سطحی معادل ۳۰ ± ۷۲.۷۴ میکرو مولار تولید کند. این سطح، بسیار نزدیک به غلظت بهینه ۸۰ میکرو مولار PCA بود که در آزمایش‌های اولیه شناسایی شده بود. نتیجه این بهینه‌سازی، یک افزایش چشمگیر در تولید برق بود: سویه SO3 حداکثر چگالی توانی معادل ۹۱ ± ۱۷۵۷.۸۷ میلی‌وات بر متر مربع را به ثبت رساند.

برتری روش‌شناختی نسبت به مطالعات قبلی

پژوهشگران اشاره کردند که اگرچه بیوسنتز PCA پیش از این در سایر میکروارگانیسم‌ها (از جمله E. coli، P. putida و سیانوباکترها) برای افزایش EET پیاده‌سازی شده بود، اما مطالعات قبلی به طور سیستماتیک تنظیم دقیق سطح بیوسنتز PCA و رابطه وابسته به دوز PCA در میانجی‌گری EET را بررسی نکرده بودند. این کمبود در تحقیقات پیشین، مانع از دستیابی به پتانسیل کامل PCA در تسهیل کارآمد EET می‌شد. این مطالعه جدید با تمرکز بر این جنبه‌های مهم، گامی فراتر گذاشت.

تسهیل انتقال PCA به خارج از سلول: نقش پروتئین OprF

تولید PCA در داخل سلول به تنهایی کافی نیست؛ برای اینکه این شاتل الکترونی بتواند وظیفه خود را به بهترین شکل انجام دهد، باید به خارج از سلول منتقل شده و در آنجا به الکترود دسترسی پیدا کند. برای تسهیل انتقال PCA از داخل سلول به خارج، پژوهشگران پروتئین پورین OprF را در سویه SO3 بیان کردند. پورین‌ها کانال‌هایی در غشای خارجی باکتری‌ها هستند که به مولکول‌های کوچک اجازه عبور می‌دهند و بیان OprF برای افزایش نفوذپذیری غشای سلولی طراحی شد.

سویه حاصل، SP1 (که هم شامل مسیر بیوسنتز Ptac-phzABCDEFG و هم بیان PlacUV5-oprF بود)، حداکثر چگالی توان ۹۲ ± ۲۲۶۲.۴۵ میلی‌وات بر متر مربع را به نمایش گذاشت. این میزان، ۲۹/۱ برابر بالاتر از سویه SO3 بود. این نتیجه به وضوح نشان داد که تسهیل خروج PCA از سلول، گامی حیاتی در افزایش بیشتر EET است.

مکانیسم الکتروفیزیولوژیکی و چالش‌های جدید

تحلیل‌های الکتروفیزیولوژی سلولی نشان داد که PCA تولید شده در داخل سلول، با کمک OprF به خارج از سلول منتقل می‌شود. در خارج از سلول، PCA توسط سیتوکروم‌های c غشای خارجی (outer membrane c-Cyts) مانند MtrC و OmcA کاهش یافته و سپس الکترون‌ها را به الکترود منتقل می‌کند و به این ترتیب، EET را تسریع می‌بخشد. مطالعات قبلی نیز نشان داده بودند که پورین‌هایی مانند OprF می‌توانند انتقال فلاوین‌ها (به عنوان شاتل‌های الکترونی) را تسریع کنند و OprF برای افزایش EET مورد استفاده قرار گرفته بود. با این حال، مکانیسم الکتروفیزیولوژیکی اساسی که به واسطه آن OprF، شاتل‌های الکترونی و c-Cyts به طور همزمان EET را تسریع می‌کنند، پیش از این به طور سیستماتیک روشن نشده بود. این مطالعه به ارائه درک عمیق‌تری از این تعاملات پیچیده کمک کرد.

با این حال، این پیشرفت با یک چالش جدید همراه بود: پژوهشگران دریافتند که سویه SP1 کاهش قابل توجهی در نرخ رشد سلولی در مقایسه با سویه والد خود، SO3، نشان می‌دهد. این مشاهده، یک مسئله مهندسی اضافی را آشکار کرد که مربوط به سمیت OprF برای سلول بود. افزایش نفوذپذیری غشا، در حالی که برای خروج PCA مفید بود، به نظر می‌رسید بر سلامت کلی سلول تأثیر منفی می‌گذارد.

جداسازی پویا و بهینه‌سازی دقیق: دستیابی به حداکثر پتانسیل

برای رفع مشکل سمیت OprF و حفظ رشد سلولی، محققان یک استراتژی تنظیمی پویا مبتنی بر بیوسنسور PCA را توسعه دادند تا بیوسنتز PCA و انتقال آن را به صورت پویا از هم جدا کنند. ایده اصلی این بود: در ابتدا، PCA سنتز می‌شود، در حالی که OprF هنوز بیان نمی‌شود. هنگامی که غلظت PCA به یک آستانه خاص رسید (که توسط یک بیوسنسور PCA تشخیص داده می‌شود)، بیان OprF متعاقباً آغاز می‌شود تا انتقال PCA به خارج از سلول را تسهیل کند. این رویکرد هوشمندانه، با هدف کاهش مواجهه سلول با سمیت OprF در مراحل اولیه و تضمین بیان آن تنها در زمان نیاز بود.

برای این منظور، یک بیوسنسور PCA به نام PsoxR-soxR-PsoxS طراحی و در سویه SD1 (حاوی Ptac-phzABCDEFG و PsoxR-soxR-PsoxS-oprF) پیاده‌سازی شد. با این حال، به دلیل تأخیر و ضعف در بیان OprF که توسط این بیوسنسور PCA تنظیم می‌شد، نرخ EET سویه SD1 مهار شد و چگالی توان آن (۴۰ ± ۱۷۹۷.۶۴ میلی‌وات بر متر مربع) پایین‌تر از سویه والد خود، SP1 (۹۲ ± ۲۲۶۲.۴۵ میلی‌وات بر متر مربع) بود.

بهینه‌سازی بیوسنسور با جهش‌زایی هدفمند

برای حل این مشکل، پژوهشگران به سراغ رویکرد جهش‌زایی هدفمند (site-specific mutagenesis) رفتند تا بیوسنسور PCA را بهینه‌سازی کرده و به قدرت پاسخ و حساسیت مناسب دست یابند. این تلاش منجر به توسعه ۹ واریانت بیوسنسور PCA به نام‌های PsoxR-soxR-PsoxS V1-V9 شد. این بیوسنسورهای بهینه‌شده سپس برای ساخت ۹ سویه نوترکیب به نام‌های SDV1-9 مورد استفاده قرار گرفتند.

از میان این ۹ سویه، سویه SDV3 (که شامل Ptac-phzABCDEFG و بیوسنسور PsoxR-soxR-PsoxS V3-oprF بود)، بالاترین نرخ EET را به نمایش گذاشت و به حداکثر چگالی توان ۱۹ ± ۲۸۴۵.۲۶ میلی‌وات بر متر مربع دست یافت. این دستاورد یک موفقیت بی‌سابقه بود؛ چگالی توان سویه SDV3 به ترتیب ۲۶/۱ برابر بیشتر از سویه SP1 و ۷۵/۳۳ برابر بیشتر از سویه وحشی (WT) بود.

پژوهشگران اشاره کردند که این چگالی توان خروجی، یکی از بالاترین مقادیر ثبت‌شده توسط اگزوالکتروژن‌های نوترکیب تا به امروز است، که بر اهمیت و نوآوری این کار تأکید می‌کند. این نتیجه نشان می‌دهد که با طراحی دقیق و بهینه‌سازی سیستم‌های بیولوژیکی، می‌توان به سطوحی از عملکرد دست یافت که پیش از این غیرقابل تصور بودند.

روشن‌ساختن مکانیسم‌های اساسی: چگونه PCA EET را تقویت می‌کند؟

در نهایت، این مطالعه به روشن‌ساختن مکانیسم‌های مولکولی اساسی که منجر به افزایش EET با واسطه PCA می‌شوند، پرداخت. پژوهشگران دریافتند که PCA می‌تواند متابولیسم لاکتات، بیوسنتز c-Cyts و تشکیل بیوفیلم را از طریق افزایش سطح cAMP (سیکلیک آدنوزین مونوفسفات) تقویت کند. این اثرات، به طور جزئی به افزایش EET در S. oneidensis کمک می‌کنند. cAMP یک مولکول پیام‌رسان ثانویه مهم است که در تنظیم بسیاری از فرآیندهای سلولی نقش دارد و افزایش آن نشان‌دهنده یک تنظیم سیگنالینگ پیچیده است.

علاوه بر این، تحلیل‌ها نشان داد که مکانیسم غالب در افزایش EET با واسطه PCA، عمل کردن PCA به عنوان واسطه الکترونی (electron mediator) برای انتقال الکترون‌ها از سیتوکروم‌های c غشای خارجی (MtrC و OmcA) به الکترود است. الکترون‌های داخل سلولی از طریق c-Cyts MtrC و OmcA به مولکول‌های PCA خارج سلولی منتقل می‌شوند، و این فرآیند به غلظت PCA وابسته است.

دو حالت عملکردی PCA در غلظت‌های مختلف

پژوهشگران دو حالت عملکردی برای PCA را شناسایی کردند که به غلظت آن بستگی دارد:

• در غلظت‌های پایین: PCA به عنوان یک کوفاکتور (cofactor) عمل می‌کند که به MtrC و OmcA متصل می‌شود تا EET را تسهیل کند. این اتصال، نشان‌دهنده یک تعامل نزدیک و ساختاری بین PCA و پروتئین‌های اصلی انتقال الکترون است.
• با افزایش غلظت PCA: جایگاه‌های اتصال PCA در MtrC و OmcA اشباع می‌شوند. در این حالت، PCA اضافی در حالت آزاد (free state) از طریق انتشار (diffusion) به انتقال الکترون‌ها کمک می‌کند. این بدان معناست که در غلظت‌های بالاتر، PCA به صورت مستقل‌تری عمل می‌کند و به عنوان یک شاتل الکترونی متحرک، الکترون‌ها را بین باکتری و الکترود جابجا می‌کند.

نتیجه‌گیری: یک استراتژی کارآمد برای آینده تولید برق زیستی

به طور کلی، این مطالعه به وضوح نشان داد که سنتز پویا و انتقال PCA یک استراتژی بسیار کارآمد برای افزایش EET در S. oneidensis است. این کار نه تنها به بالاترین چگالی توان خروجی ثبت‌شده توسط اگزوالکتروژن‌های نوترکیب دست یافته است، بلکه درک عمیق‌تری از مکانیسم‌های مولکولی زیربنایی را نیز ارائه می‌دهد.

این دستاوردهای چشمگیر، افق‌های جدیدی را برای مهندسی میکروارگانیسم‌ها جهت کاربردهای بیوتکنولوژیکی و محیط‌زیستی باز می‌کند. با توانایی کنترل دقیق بیوسنتز و انتقال شاتل‌های الکترونی مانند PCA، می‌توانیم پتانسیل کامل باکتری‌های تولیدکننده برق را برای تولید پایدار و کارآمد انرژی از منابع زیستی آزاد کنیم. این پژوهش، گامی مهم در جهت تحقق آینده‌ای است که در آن، میکروارگانیسم‌ها نقش کلیدی در تأمین نیازهای انرژی ما ایفا می‌کنند.

منبع :

Dynamic synthesis and transport of phenazine-1-carboxylic acid to boost extracellular electron transfer rate